设计引物时，如何检测 PCR 引物特异性？

茫茫的实验过程中，你是否遇到过如下的困境：

• 做完 PCR，跑胶发现有多条很诡异的条带……

• 更为可怕的是，做完二代测序发现了一个崭新的突变点，一代测序验证也能开心的验证出来，但发文章时，别人告诉我们，这其实是相似序列引发的假阳性……也就是说，相似序列之间的差异碱基，刚好就是那个所谓的突变点！一代测序也枉然！

以上的问题，可能多半都是因为引物不特异。

也就是说，同一对引物，能匹配基因组上好几个位置。

所以，设计完引物，做一个在线的 PCR，以保证引物的特异性，是特别好的习惯~

下面分享两个可以完成此任务的在线工具！

1. Primer-BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi

以 ERBB2 基因的某个外显子为例，序列如下：

随意拉出一对引物

F: CAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCT

R: ACCCTAGAGTCTCATTGGGCAGGGCC

用以扩增出此段的 DNA 序列，打开 PRIMER-BLAST，Template 空置，引物填入对应的位置

PCR 产物最大值可以根据，实验具体情况进行调整，选择物种，此处是以人基因组 DNA 模版为例（如果做 RNA 层面研究，可以选取 mRNA）

点击 Get Primer，得到结果

可以看到产物是唯一的，再试另外一对引物（MUC4 基因）

可见此对引物，可以扩增出基因组上两段产物。而且是引物完全匹配，在不知情的情况下，可能会得到非常有迷惑性的实验结果，这预计也是 MUC4 在很多数据库中都有高突变频率的原因，存在大量的因重复序列造成的假阳性。

http://genome.ucsc.edu

简单易用，直接把上下游引物输入即可。依次再测试一下上面的两对引物。

第一对：

可以看到结果是唯一的！

第二对：

出现了两个扩增产物，此结果中，两个产物的长度差异较大，相对比较容易甄别。对于一些长度差异较小的，可能会对实验结果造成极大的干扰，而且可能打击实验的积极性~

今天就到这里啦，希望各位小伙伴实验顺顺利利！