菌落 PCR（Colony PCR）：操作方法与注意事项

菌落 PCR（Colony PCR）可不必提取基因组 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者 DNA 测序分析。最后的 PCR 产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

具体方法：

1、PCR 混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH ₂ O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul 每管分装于 200 ul PCR 管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在 LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装 有PCR混合物的 PCR 管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是 1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的 PCR 混合物置于 PCR 仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置 37℃ 培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤 2 也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做 PCR 的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项 ：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如 pET 系列可用 T7 通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR 条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。