菌落 PCR 实验

常规的 PCR 扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增，操作繁琐， 耗时较长，同时在反复的操作中 DNA 量损失也较大，产率较低。在 1989 年 Gussow Clackson 建立了菌落 PCR（colony PCR）法，菌落 PCR 与我们通常的普通 DNA 的 PCR 的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落，操作简单、快速，在转化鉴定中较常用。

菌落 PCR 实验的基本原理是以单个菌落作为模板，用无菌牙 签挑取单个菌落到 TE 缓冲液中，煮沸 10 min，涡旋振荡后短暂离心，用 1~2 国裂解液作为 DNA 模板，省去抽提模板 DNA 这一步，通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增，大大节约了时间和成本。

器材：

固体平板培养基上培养出的单菌落、高压灭菌牙签、抗性平板、EP 管、离心机等。

试剂：

10 × PCR 缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 500 mmol/L KC1；0. 1% 明胶；15 mmol/L MgCl₂）、目的基因引物、Triton × 100。

1、用高压灭菌的牙签挑取单个菌落，先在含抗性的平板上画线，做保种用，然后将牙签置于 20 μL Triton × 100 中搅和一下，以便悬浮涂在牙签上的菌，将相应的菌和平板上的画线区做上对应的记号。

2、将装有 20 μL Triton × 100 的 EP 管煮沸 10 min，冷却后 12000 r/min 离心 1 min 去除细胞碎片。

3、按照预期包含的质粒加好反应体系（25 μL）：

4、PCR 扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 循环；72 ℃ 5 min；4 ℃ 保存。

5、电泳，观察结果，对阳性的结果相对应的主平板上的菌落保种或者进行测序。

1、菌落 PCR 时，加入菌液模板的体积不能过大，否则会影响 PCR 体系，导致扩增失败，一般取 1~2 μL 做 25 μL 的 PCR 体系。模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩增不出来，这种现 象在以质粒为模板的 PCR 里面很多，提出来的质粒不要忘记稀释。

2、减少扩增循环，25~30 个循环对于菌落 PCR 是比较合适，扩增循环过多，会产生假阳性。

3、假阳性的控制。如果用载体引物来扩增一般可以降低假阳性，或者多用几对不同的引物扩增，以增加真阳性的筛选结果，PCR 结果最好做酶切鉴定。

4、PCR 条件的控制。热启动可以消除引物二聚体，退火温度可以稍低。