同源重组第一次交换后菌落pcr没有带为什么
诶呦喂666
大家好，我最近在做一个阳性菌的基因敲除，目前将目的片段连接自杀质粒(Amp抗性)已完成。接下来，我用电转化法把重组质粒转化进我的阳性菌，用含Amp的抗性LB平板进行筛选，但是板子上一直不长菌，实在是不知道为什么做不出来了。
实验步骤如下：
烟草节杆菌感受态制备：
1：从-80℃冰箱拿出保的菌株，28℃，200rpm过夜培养；
2：以1:100比例将1ml菌液转移至100ml培养基中，28℃，200rpm培养至OD600=0.5，加入70ug/ml的青霉素G再继续培养一小时。3：冰上静置10min，4000rpm，15min，4℃离心，弃上清，加入预冷的10％甘油+山梨醇溶液洗涤三次，最后用1ml悬浮菌体，100ul一管分装，-80℃保存。
电转：取1~2ug质粒DNA与100ul感受态混合后加入2mm电转杯中，2500V,25uf，800Ω电击，脉冲18~19ms，迅速加入800ulLB和山梨醇复苏溶液30℃，200rpm培养1h，4000rpm，4min离心后，剩余100ul悬浮菌体涂布于氨苄抗性平板上。
之前都是加200ng左右的质粒但一直不成功，不长菌，看到别人用2ug左右的质粒也可以电转成功，我就试了一下，但是发现培养完在最后悬浮菌体涂板时，菌体粘稠，这个现象很不正常，但不知道是什么问题
因为目前整个实验楼层只有我一个人做敲除，没有师兄师姐带，所以很多步骤都不确定，希望各位做过相似实验的小伙伴可以帮帮我，谢谢啦～
2 个回答
loveliufudan
同源重组的第一次交换需要确保有足够的质粒模板和恰当的条件。如果PCR没有出现目标带，可能是以下原因之一：
质粒模板的浓度不足。如果使用的质粒量太少，PCR扩增可能不足以产生足够的目标带。建议使用更高浓度的质粒模板，并在PCR反应中增加扩增周期数和/或使用更高灵敏度的PCR酶。
PCR反应条件不恰当。PCR反应温度和时间以及PCR缓冲液成分可能影响PCR扩增结果。建议调整PCR反应条件，尝试更多的PCR缓冲液，扩增时间和温度，并尝试不同的PCR酶。
质粒模板被降解。如果质粒模板在保存或操作过程中受到损伤或降解，可能会导致PCR扩增失败。建议使用新鲜的质粒模板并在保存时储存于-20℃冰箱中。
另外，关于菌体粘稠的问题，这可能是菌体在培养过程中产生的胶体物质，也可能是感染病毒导致的细胞溶解物。建议在培养时注意菌液的稀释比例，使用合适的培养基和培养条件，并检查细胞是否感染病毒。
毛利小五郎的徒弟
可以考虑更换质粒，考虑是载体质粒不合适
