诶呦喂666
大家好,我最近在做一个阳性菌的基因敲除,目前将目的片段连接自杀质粒(Amp抗性)已完成。接下来,我用电转化法把重组质粒转化进我的阳性菌,用含Amp的抗性LB平板进行筛选,但是板子上一直不长菌,实在是不知道为什么做不出来了。
实验步骤如下:
烟草节杆菌感受态制备:
1:从-80℃冰箱拿出保的菌株,28℃,200rpm过夜培养;
2:以1:100比例将1ml菌液转移至100ml培养基中,28℃,200rpm培养至OD600=0.5,加入70ug/ml的青霉素G再继续培养一小时。3:冰上静置10min,4000rpm,15min,4℃离心,弃上清,加入预冷的10%甘油+山梨醇溶液洗涤三次,最后用1ml悬浮菌体,100ul一管分装,-80℃保存。
电转:取1~2ug质粒DNA与100ul感受态混合后加入2mm电转杯中,2500V,25uf,800Ω电击,脉冲18~19ms,迅速加入800ulLB和山梨醇复苏溶液30℃,200rpm培养1h,4000rpm,4min离心后,剩余100ul悬浮菌体涂布于氨苄抗性平板上。
之前都是加200ng左右的质粒但一直不成功,不长菌,看到别人用2ug左右的质粒也可以电转成功,我就试了一下,但是发现培养完在最后悬浮菌体涂板时,菌体粘稠,这个现象很不正常,但不知道是什么问题
因为目前整个实验楼层只有我一个人做敲除,没有师兄师姐带,所以很多步骤都不确定,希望各位做过相似实验的小伙伴可以帮帮我,谢谢啦~
loveliufudan
同源重组的第一次交换需要确保有足够的质粒模板和恰当的条件。如果PCR没有出现目标带,可能是以下原因之一:
质粒模板的浓度不足。如果使用的质粒量太少,PCR扩增可能不足以产生足够的目标带。建议使用更高浓度的质粒模板,并在PCR反应中增加扩增周期数和/或使用更高灵敏度的PCR酶。
PCR反应条件不恰当。PCR反应温度和时间以及PCR缓冲液成分可能影响PCR扩增结果。建议调整PCR反应条件,尝试更多的PCR缓冲液,扩增时间和温度,并尝试不同的PCR酶。
质粒模板被降解。如果质粒模板在保存或操作过程中受到损伤或降解,可能会导致PCR扩增失败。建议使用新鲜的质粒模板并在保存时储存于-20℃冰箱中。
另外,关于菌体粘稠的问题,这可能是菌体在培养过程中产生的胶体物质,也可能是感染病毒导致的细胞溶解物。建议在培养时注意菌液的稀释比例,使用合适的培养基和培养条件,并检查细胞是否感染病毒。
土井挞克树
可以考虑更换质粒,考虑是载体质粒不合适
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