PCR技术（七）：mRNA差异PCR技术

生物界的丰富多彩很大程度上取决于严格调控下的基因的选择性表达。高等生物的细胞内约含有105 个不同的基因，而主 基因在某个特定的细胞中，只有占15 ％的一小部分表达。而且在不同的细胞中，选择性表达的基础也是不同的。正是这些基因的选择不同决定了整个生命的过程：如细胞的生长分化，激素和细胞困子对细胞的作用、细胞周期的调控以及衰老、死亡等。和细胞的正常生理一样，一些病理的反应如肿瘤等也是由基因表达的改变引起的。所以，这种基因的选择性表达，是细胞生物学要研究的核心问题之一，而对于这一问题的研究方法也是分析生物发育和调控机制的一种重要方法。

　　以往，研究基因表达差异的主要方法是双向蛋白质电泳指纹图谱和依赖杂交的筛选技术。这两种技术各有自己的适用范围和优点。蛋白质指纹技术具有很高的灵敏度，可以很方便地区分出不同的表达产物，但往往得不到足够的量来分析和克隆它们的基因；而杂交技术则需要较长的周期和繁琐的步骤，也易发生基因的丢失。所以多年以来，人们一直想找出一种更方便有效的替代方法。

　　哈佛大学医学院的Ｐeng Ｌiang 和Ａrthur Ｂ．Ｐardee 博士发明的m ＲＮＡ差别显示即ＤＤ法（differential display of m ＲＮＡ by ＰＣＲ）， 是一种新的研究基因差异表达的有力工具。这个方法的离要程序是将细胞内的m ＲＮＡ抽提出来，反复录成c ＤＮＡ，尔后经ＰＣＲ随机扩增， 通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些ＤＮＡ片段，经扩增后作为探针，在c ＤＮＡ或基因组ＤＮＡ库中扫描找到相关基因。原则上如果选用不同的引物组合，这个方法可以检测到细胞中约15000 种不同基因的表达情况， 这就给出了一个类似于蛋双向电泳的指纹图谱，基因表达的不同马上就可以知道，并因此分离到该基因。

　　由于这种方法主要依赖于ＰＣＲ技术，所以选择合知的引物是这一方法成功的关链。用于逆转录合成单链c ＤＮＡ和ＰＣＲ扩增的３' 引物设计得益于许多真m ＲＮＡ共有的poly Ａ尾巴，所以oligo d Ｔ作引物就可锚定在poly Ａ上。 加之又在引物的３' 端加了两个碱基，它们将随机地与m ＲＮＡ的poly Ａ上游两个碱基配对，由于这两个碱基有12 种不同的组合，从而将有的m ＲＮＡ分成12 个组。 这样就减少了每次分析的m ＲＮＡ数量，提高了分辨率。后来这一引物的设计又得到了改进， 将倒数第二个碱基改成了一个简并碱基，从而将３' 引物的数量减少到４个， 分别是５' Ｔ12 ＮＡ３' 、５'12 ＮＧ３' 、５' Ｔ12 ＮＴ３' 和５'12 ＮＣ３' （其中Ｎ是d Ａ、d Ｇ或d Ｃ），这样就将所有m ＲＮＡ分成了４组， 这一改进既减少了引物的用量和需要分析的次数，又保证了足以灵敏地检测到所有可能的表达产物。

　　在获得c ＤＮＡ以后进行的ＰＣＲ扩增中，５' 所用的引物是一组随机引物，引物的选择关键在于它们的长度。理论上这个长度要满足两个条件：一是要和m ＲＮＡ有合适的配对效率，其次则是必须符合ＰＣＲ引物的要求。从为了获得较高的配对概率来讲，这个引物应足够短，以具有更高的灵敏度，６到７个碱基被认为是合适的长度。但是很明显，这样一个引物用于ＰＣＲ扩增是太短的，虽说在用ＰＣＲ研究 ＤＮＡ多态性的实验中，8 ￣10 个碱基长的引物也被应用，但一般ＰＣＲ所用的上物往往有20 个碱基或更长。经过选择不同长度引物是适宜的，下表是实验的结果：

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随相引物的长度 配对几率 陈列的m ＲＮＡ数

（个）

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（碱基数） （千碱基/ 配对位点） 理论值 实际结果

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6 4 150 0

7 16 38 0

8 65 10 0

9 262 2 20 ￣80

10 1049 <1 50 ￣100

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　　从表中可以看出，实验结果和理论值有很大的差别。其原因可能是短的引物虽然具有较启的配对几率，却困为退火温度太低而使实际扩增数降低。相反地，10 个碱基的引物具有足够高的退火温度，其实际扩增出来的数目出人意料地高，可能是因为ＰＣＲ开始几轮，相物和m ＲＮＡ配对时，５' 端是松散的，使得实际配对的碱基数少于10 ，所以大大地增加了配对的几率。这一设想可通过只改变５' 端的碱基会得到同样的扩增结果来证明10 个碱基长度的这些引物，扩增出来的条带的长度一般为100 ￣500 个碱基，更适合于后来的凝胶电泳分析。从概率上来讲，在500 个碱基长的序列中存在任何一个这样的引物序列的几率是0.05 ，所以，有20 个这样的引物就可以覆盖所有的m ＲＮＡ顺序。 当然这里的ＰＣＲ条件和一般的反应条件有所不同，同时要用35 Ｓ的d ＡＴＰ或d ＣＴＰ标记，以便在电泳后进行放射自显影检测。

　　m ＲＮＡ的扩增产物可以在４％和ＤＮＡ测序胶上电泳，然后作放射自显影。如果将不同的细胞可不同条件下处理过细胞的扩增产物并排走一起，我们就很容易辨别出它们的表达差异。而且，这些条带可发言人人凝胶中回收，经第二轮ＰＣＲ特异性扩增后获得卟够的量，用于制成相应的探针，来找出未知的差异表达的基因。

　　由此可见，这一方法可以替代80 年代就已发展起来的差减基因克隆的方法。那么，它和差减法相比有什么优点呢？归纳起来有以下几个方面：

　　1．简单易行：这一方法主要依靠的技术只有两种，ＰＣＲ的ＤＮＡ测序凝胶电泳，而这两种方法都是非常成熟的。

　　2．灵敏度高：用这种m ＲＮＡ差别显示技术，只需要20 μg 的m ＲＮＡ， 而差减法则需要至少200 μg 的m ＲＮＡ或细胞总ＲＮＡ。

　　3．重复性好：90 ％￣95 ％的m ＲＮＡ可以被重复显示。

　　4．多能性：一次实验可以比较很多个不同的种类，而且它可以进行细胞间的双向比较，所以不仅能显示例如癌基因的表达，而且可以检测到诸如抑癌基因一类基因的表达。

　　5．快速：应用这一方法，两天之内可以检到m ＲＮＡ的差异， 从重新扩增到Ｎorthern 杂交一般只需一周的时间。而且，这一方法从头至尾， 我们都可以监测它的进行情况，而不象其它方法那样要到最后才能知道系统是否工作。

　　正是这些显著的优点，使得这一方法得到了格外的重视，在很多场合加以应用。首先是用来快速分析细胞在不同条件下基因的表达差异，其次是用于快速克隆有表达差异的基因。这里最典型的例子是肿瘤细胞和下沉细胞的表达差异的研究，如α-integrin 从乳腺癌细胞中的克隆即是用了这一方法。 随着越来越多的人知道并动用它，这一方法在细胞内信号传导、细胞周期调控和发育等方面的研究中也将是非常有应用前途的。