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mRNA 的 PCR 差异显示

相关实验:mRNA 的 PCR 差异显示实验

最新修订时间:

材料与仪器

人的细胞总 RNA 或 poly(A)+ RNA
人胎盘 RNase 抑制剂 DNase I Tris·Cl KCl MgCl2 3:1 (V V) 苯酚 氯仿 乙酸钠 乙醇 DEPC 处理的水 简并锚定 oligo(dT) 引物组合 MoMuLV 逆转录酶缓冲液 DTT 4dNTP 混合物 MoMuLV 逆转录酶 PCR 扩增缓冲液 [α-33P] dATP 随机十聚体 Taq DNA 聚合酶 矿物油 甲酰胺上样缓冲液 糖原(无 DNase)
65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴 热循环仪 Whatman 3 MM 滤纸​

步骤

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」


1. 消化细胞总 RNA 或 poly(A) RNA 中的 DNA:

50 ug RNA

10 ul 1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂

1 /ul 10 U/ul 无 RNase 的 DNase I

5 ul 0.1 mol/L Tris·Cl,pH 8.3

5 ul 0.5 mol/L KCl

5 ul 15 mmol/L MgCl2

加水到 50 ul

37℃ 温育 30 min。


2. 加入 50 ul 酚/氯仿(3:1),涡旋混勻,最高速离心 2 min 分相。


3. 转移上层到一个干净的微量离心管中,加入 5 ul 3 mol/L 的乙酸铵和 200 ul 100% 乙 醇。-70℃ 放置 30 min 沉淀 RNA。


4. 高速离心 10 min。去除上清,用 500 ul 70% 的乙醇洗涤沉淀(沉淀的 RNA)。


5. 溶解 RNA 沉淀于 20 ul DEPC 处理水,用分光光度计测量 A260 准确定量 RNA 的浓度。


6. 用琼脂糖/甲醛凝胶电泳分析 3 ug 用作差异显示分析的 RNA,检査 RNA 的完整性。无 DNA 的 RNA 保存在 -80℃ 直到做差异显示分析。


7. 对于每一个 RNA 样品,标记 4 个微量离心管为 G、A、T 和 C 个管子对应一个简并锚定 oligo (dT) 引物。


8. 把 1 ug 无 DNA 的 RNA (步骤 5)稀释到 0.1 ug/ul, 置于冰上。


9. 用 4 个不同的简并锚定引物(5'-T12MN-3';T12MG、T12MA、T12MT、T12MC,M 是 G、A 或 C) 配制无 DNA 的总 RNA 或 poly (A) RNA 的逆转录反应:

4 ul 5×MoMuLV 逆转录酶缓冲液(终浓度 1×)

2 ul 0.1 mol/L DTT (终浓度 10 mmol/L)

1.6 ul 250 umol/L 4dNTP 混合物(终浓度 250 mmol/L)

0.2 ug 总 RNA 或 0.1 ug poly (A) RNA

2 ul 一个 10 umol/L 简并锚定 oligo(dT) 引物(T12MN; 终浓度 1 umol/L)

DEPC 处理水调整体积到 19 ul。


10. 65℃ 温育 5 min 变性 mRNA 的二级结构,继续 37℃ 温育 10 min 复性引物。


11. 每管加入 1 ul 200 U/ul 的 MoMuLV 逆转录酶,混匀,37℃ 温育 50 min。


12. 95℃ 加热 5 min,灭活逆转录酶,高速离心把溶液收集到管底。把管子放在冰上马上准备 PCR,或保存在 -20℃ 以备日后使用(可以稳定保存至少 6 个月)。


13. 为每个引物准备如下 20 ul 的反应混合液:

10 ul H2O

2 ul 10× 扩增缓冲液(终浓度 1×

1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物(终浓度 2 umol/L)

0.2 ul [α-33P] dATP

2 ul 12 umol/L 的随机十聚体(终浓度 0.2 umol/L)

2 ul 10 umol/L 的简并锚定 oligo(dT) 引物(T12MN; 终浓度 1 mmol/L)

2 ul cDNA (12 步)

0.25 U 5 U/ul Taq DNA 聚合酶


14. 上下吹吸混勻,覆盖 25 ml 矿物油。


15. 在热循环仪上用如下程序扩增:

40 轮:

30 s 94℃ (变性)

2 min 40℃ (复性)

30 s 72℃ (延伸)

1 轮:

5 min 72℃ (延伸)

最后一步:4 C (保持)


16. 混合 3.5 ul PCR 产物和 2 ul 甲酰胺上样缓冲液,80℃ 加热 2 min。上样到 6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上。60W 电泳约 3 h 直到二甲苯青走到离底部 10 cm 以内。


17. 小心移去凝胶上的一块玻璃板。把一张 Whatman 3 MM 滤纸覆盖在凝胶上,在凝胶和滤纸之间不要留有气泡。不需要在甲醇/乙酸中固定,室温干凝胶约 1 h。


18. 使用放射性墨水或钟头打孔器标记 X 射线胶片和干好的凝胶移确定它们的方向。室温曝光 24~48 h。


19. 洗片,把凝胶片和凝胶比照,标出感兴趣的 DNA 条带(在不同泳道差异显示的条带)或用一支干净的铅笔或割穿凝胶片在凝胶片下作标记。


20. 用刀片割出凝胶块和黏附其上的 Whatman 3 MM 滤纸,放人一个微量离心管。加入 100 ul H2O, 室温浸泡 10 min。


21. 盖上管子煮沸 15 min。


22. 高速离心两分钟沉淀凝胶块和滤纸残渣。转移上清到一个干净的管子里。


23. 上清中加入 10 ul 3 mol/L 的乙酸钠(终浓度 0.3 mol/L) 和 5 ul 10 mg/ml 的糖原 (作为载体)。加入 400 ul 100% 的乙醇,-70℃ 放置 30 min。4℃ 高速离心 10 min。


24. 用 500 ul 85% 的乙醇洗涤沉淀,晾干,重新溶解于 10 ul H2O 中。


25. 在一个 40 ul 的反应体积里再次扩增 4 ul 洗脱的 DNA。使用和步骤 13~15 中同样的简并描定引物和 PCR 条件,不同的是加入 250 umol/L 4dNTP 混合物(终浓度 20 umol/L) 代替 1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物,也不加同位素。-20℃ 保存剩余的回收 DNA 以备将来扩增(可稳定数年)。


26. 取每个 PCR 样品 30 ul 在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳,用 0.5 ug/ml 的 EB 染色。20℃ 保存剩余的 PCR 样品(可以稳定保存数年)。


27. 从琼脂糖凝胶上抽提所希望扩增的 DNA 条带。用它作探针进行 North-era 印迹分析和 cDNA 库的筛选。


28. 亚克隆,测序鉴定余下的 PCR 样品。

注意事项

必须由受过正确使用 33P 同位素的人员在经 NRC 认证的地方进行。防止过量的照射,必须始终贯彻人员和仪器的同位素污染防范标准。

常见问题

1. 材料

人的细胞总 RNA 或 poly (A) RNA


2. 试剂

1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂

10 U/ul DNase I (无 RNase)

0.1 mol/L Tris·Cl,pH 8.3

0.5 mol/L KCl

15 mmol/L MgCl2

3:1 (V/V) 苯酚/氯仿

3 mol/L 乙酸钠,pH 5.2

100%、70% 和 85% 的乙醇

DEPC 处理的水

浓度各为 10 umol/L 的简并锚定 oligo(dT) 引物组合 (如 Genhunter): T12MG、T12MA、T12MT, T12MC (M 代表 G、A 或 C)

5 × MoMuLV 逆转录酶缓冲液

0.1 mol/L DTT

250 umol/L 和 25 umol/L 的 4dNTP 混合物

200 U/ul 的 Moloney 鼠白血病病毒(MoMuLV) 逆转录酶

10× PCR 扩增缓冲液(使用 15 mmol/L MgCl2, 0.1 mg/ml 白明凝胶;保存在 -20℃)

10 uCi/ul [α-33P] dATP(>2000 Ci/mmol)

2 umol/L 随机十聚体(如 GenHunter 或 Operon Technologies)

5 U/ul Taq DNA 聚合酶

矿物油

甲酰胺上样缓冲液

10 mg/ml 的糖原(无 DNase)


3. 耗材

65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴

热循环仪

Whatman 3 MM 滤

来源:丁香实验

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