差示反转录PCR[mRNA差异显示技术]

mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的。它也称为差示反转录PCR（differential display of reverse transcriptional PCR）简称DDRT-PCR。

mRNA差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。

其基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。

根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。

根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。

于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。

随着mRNA差异显示技术的广泛应用，也逐渐显露出一些不足之处，如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高，差异条带分离困难，获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间，包含大量的非编码序列，不利于同源性比较分析等。

以下是以红豆杉为例进行mRNA差异显示研究的具体操作。

1实验材料

1.1红豆杉细胞 未经MJ诱导处理的A<1>和经MJ诱导处理的B<1>红豆杉细胞。

1.2寡核苷酸引物

（1）3’锚定引物：

①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’

②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’

③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’

（2）5’ 随机引物：

Kit引物：

①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’

②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’

③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’

④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’

⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’

⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’

⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’

⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’

生工引物：

①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’

②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’

③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’

④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’

⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’

⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’

⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’

⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

特异引物：

①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’

②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’

③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’

④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’

⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’

⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’

⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

1.3主要试剂

（1）RNA提取

柠檬酸钠(Sodum citrate)，十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine），巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，异硫氰酸胍(guanidine isothiocyanate)， 焦碳酸二乙酯(DEPC)，水饱和酚等购自上海生工生物工程有限公司。

（2）逆转录及PCR扩增

SuperscriptTMⅡ试剂盒(Cat No:18064-022，Invitrogen公司），GIBCO BRL公司；RNAimage试剂盒，GenHunter公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs，华美生物工程公司；寡核苷酸引物，上海生工生物工程公司合成；其它试剂均为国产分析纯产品。

（3）PAGE凝胶检测

100bp DNA ladder(Cat No:MG0911), 华美生物工程公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，BIOMOL公司；其它试剂均为国产分析纯产品。

1.4主要仪器

PTC-100基因扩增仪（Techne公司，英国），GeneGenius 凝胶成像系统（SYNGENE公司，美国）。-70℃超低温冰箱(Thermo Forma，美国),PCR超净台(基因有限公司，美国),DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂), 5810R低温冷冻离心机(Eppendorf，德国),Micro-MB3616型高速离心机(IEC公司，美国),Vortex GENIE2(基因有限公司，美国),GeneQuant核酸定量仪(Pharmacia Biotech 公司,英国)。

CS101-2A电热鼓风干燥箱（银河，中国重庆），DYY-111 12型三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂），DYY-111 20A型DNA序列分析电泳槽（北京六一仪器厂），TY-80A脱色摇床（北京六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1　总RNA的提取与检测

（1）用品的准备

塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。

（2）试剂的配置

① CSB缓冲液
42mmol/L柠檬酸钠(Sodum citrate)
0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine)
0.2mmol/L巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)

（3）RNA提取

对悬浮培养细胞A<1>、B<1>进行RNA提取，提取步骤如下：

① 50ml离心管中加入10ml变性匀浆液，冰浴5分钟。

② 取0.5g细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200ulβ巯基乙醇，振荡混匀。

③迅速加入1ml 2mol/L乙酸钠(PH4.0)，充分混合。

④ 加入10ml水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。

⑤ 加入2ml氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。

⑥ 4℃，12,000g，离心20分钟。

⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。

⑧ 加入6ml水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。

⑨ 加入6ml氯仿:异戊醇(24:1), 剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。