如何做mRNA变性胶

变性聚丙烯酰胺凝胶，是分子生物学常用技术之一，凝胶的灌制比水平电泳槽凝胶灌制困难，漏胶和产生气泡常在所难免，需经过反复实践才能掌握其灌制技巧。

实验步骤

1. 生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火

1) 在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。

2) 65℃加热10min.

3) 加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。

2. 亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗

1) 将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)，小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，去除上清，漂洗3次。

2) 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。

3. 杂交体的生成及漂洗

1) 将上步"３"中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到上步"5"管中，轻轻混匀，室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次。

2) 用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。

3) 用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。

3. 洗涤收集mRNA

1) 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。

2)用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)。

3) 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，－２０℃沉淀过夜，12000g 离心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

4) 提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 。

5) 提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。

称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

mRNA变性胶可以用于RNA的电泳分离和检测。以下是常用的制备方法：

材料：

10% SDS溶液

40%甲醛

10 × MOPS缓冲液

步骤：

取10% SDS溶液10 ml，加入40%甲醛10 μl，混匀。

取1 × MOPS缓冲液100 ml，加入10 ml以上制备好的变性液体，混匀。

把电泳胶架倒置，倒入凝胶液（5%）并插上梳子，等凝胶凝固。

取RNA样品，加入等量的变性胶，混匀，煮沸5分钟。

冷却到室温，将样品用于凝胶电泳。

注意事项：

制备变性液体时要注意甲醛的毒性，需操作于通风良好的实验室，并注意个人防护。

在制备和使用变性胶时要避免皮肤和粘膜接触，应戴手套和护目镜等个人防护用品。

变性胶的浓度和组成可以根据实验需要进行调整。