变性胶体电泳与北方杂合分析

mRNA为单股，一般会卷绕成特定的三级结构，并与某些蛋白质结合，而以messenger ribonucleoprotein particles （mRNPs） 的型式存在于细胞内；自细胞抽取RNA时，一般会以特定步骤去除蛋白质，但仍难完全破除RNA的二/三级结构。

由于进行电泳分析时，影响核酸泳动速率的因子主要包括核酸的长度与构形 （conformation），为了去除核酸构形所造成的影响，一般以电泳分析RNA时都采用变性胶体电泳；在进行这一类电泳分析时，由于RNA已经被变性 （denature），影响其泳动速率的因子主要是长度。

一旦RNA以变性胶体电泳解析好，即可进一步进行北方转印与杂合分析。

在进行RNA变性胶体电泳分析时，如果所要分析的RNA比较小 （<1,000 bases），可以选用聚丙烯酰胺胶体 （polyacrylamide gel），此时所使用的变性剂 （denaturing reagent） 主要是尿素 （urea）；这个方法一般也被用来分析核酸定序反应的产物。

若所欲分析的RNA 分子较大， 可采用变性洋菜胶体电泳 （agarose gel electrophoresis），所使用的变性剂为 （1） glyoxal/dimethyl sulfoxide （DMSO） 或 （2）甲醛。

以glyoxal/DMSO系统进行电泳分析时，所使用的电泳缓冲液为10 mMsodium phosphate buffer （pH 7.0）；为了避免电泳进行过程中，电泳槽两边的pH落差过大，以致影响电泳的进行，最好能在两极的间加装电泳缓冲液循环装置，而且核酸泳动速率也应尽量放慢。

以甲醛为变性剂时不会有这些问题，因此操作比较省事，但必须注意，甲醛气体为有毒物质，配制甲醛洋菜胶体及进行电泳分析时应在抽气橱里操作。 本实验将采用甲醛洋菜胶体电泳法。

清理电泳槽：能否将RNase去除干净是RNA相关实验成功与否的主要决定因子。在进行RNA电泳分析时，为了避免RNase可能带来的问题，实验室内最好能腾出一套电泳器材，专门用于RNA的分析。

如果所使用的电泳槽及铸胶器一般也用于进行DNA分析的话，在进行RNA变性胶体电泳分析前应仔细地加以清理；清理时除了以中性清洁剂彻底冲洗干净外，最好再用3%过氧化氢 （H2O2） 浸泡10 min.

仪器用具：

Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器

药品试剂：

中性清洁剂 （abSolve, DuPont NEF971）3% H2O2 （过氧化氢）dH2O/DEPC

方法步骤：

◆ 进行下列步骤时，请务必戴手套！

1） 以中性清洁剂仔细清洗电泳槽，再以二次水洗去清洁剂，并稍加晾干。

2） 以3%过氧化氢注满电泳槽，放置于室温10 min.

3） 倒掉过氧化氢溶液。

4） 以dH2O/DEPC彻底地冲洗电泳槽。