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    通过测序扫描识别杂合突变

    相关实验：应用基于荧光的自动化测序进行杂合体检测实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    基因组DNA
    TE 缓冲液 寡核苷酸引物 10X PCR 扩增缓冲液 Ampli Tag Gold DNA 聚合酶 4dNTP 混合液 BigDye终止子循环序列反应试剂盒 线形丙烯酰胺 上样缓冲液
    PCR反应管 热循环 PCR 纯化旋转柱 DNA 分析系统

    步骤

    1. 设计扩增所需的寡核苷酸引物，选择的引物退火温度需要在57°C 左右，包 含 18〜22 个碱基。定位引物以确保基因内侧翼序列至少6b p 长度和每个外显子一起扩增。用 B L A S T 搜 索 （ 单元6. 3 ) 每个引物以消除非编码的重复元件，比如Alu序列或长散 在重复元件（ LINE)。 P C R 扩增和测序要使用同一个引物。 必须根据P C R 扩增和外显子序列或其他感兴趣的基因组区域设计引物。尽管有 许多电脑程序可以用来辅助设计引物， Wisconsin Package引物设计程序（Genetics Computer Group, littp://www. gcg. c o m ) 和 W I primer3 引物设计程序（ http:// w w w -genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3— w w w .cgi) 均是用户良好型的而 且设计出的引物有很好的可信度。 以上参数已被用于设计扩增一些大小在174〜421个碱基对的外显子引物。 2. 设置10(^1 P C R 反应管的扩增反应： 50〜500n g 基因组D N A ; ljumol/L 引 物 （ 用 lOpmol/L 的工作液） ； 150jumol/L 10mmol/L 4dNTP 混合液； Ijul AmpliTag Gold D N A 聚合酶； IOjl J IOXPCR 扩增缓冲液，含 I.5mmol/L MgCl2。 3. 按以下扩增循环进行P C R 。 起始步骤： 12min 95〇C (变性） 35个循环： 30s 94〇C (变性） 30s 57〇C (退火） 45s 72°C (延伸) 终止： 4min ， 720C (延伸） 。 4•用P C R 纯 化 柱 （ 如 Qiagen) 纯化P C R 产 物 （ 使用或不使用凝胶纯化法） 。琼脂糖凝 胶 电 泳 （ 附录3G ) 和标准的已知浓缩物对比，估测纯化的扩增子的质量和浓度。或 者在测序前测量〇〇26( )值 （ 附录3D ) 以定量D N A 。 5•用双蒸水将ZSOjumol/L 的引物储存液稀释成2.5〜3.2； xmol/L 的工作液。根据厂家 的 BigDye测序方案设定所感兴趣的扩增子的序列反应循环，并略做如下几处修改: 2. J^igDye终止子预备的反应混合液j 1〜I.3n g 纯化的扩增子作为模板（ > 2 0 n g 时，效果更好） ； 加双蒸水定容至7.4W 。 . 6•将反应管置于热循环仪并设置循环如下。
    25个循环： IOs 96°C (变性） 5s 50°C (退火） 4min 60°C (延伸） 4°C储存样品纯化待用。 7. 为纯化测序的延伸产物，要进行两次乙醇沉淀（ 附录3B ) 或旋式柱纯化 乙醇沉淀法中，用线形丙婦酰胺作载体使D N A 颗粒可见。干燥 D N A 颗粒^重寿；于^ 1.2〜2jul上样缓冲液中。 8. 将样品上于ABI377测序胶。包括对照在内进行双向测序。 9. 选择软件工具将A B I 层析图数据转换成数字信息进行分析，检 测突变。 由 于 G A P 4 和 PolyPhred只 能 在 U n i x 平 台 运 行 ， 为 了 将 在 Macintosh电 脑 上 的 序 列 信 息 输 入 转 换 到 合 适 的 U n i x 主 机 上 ， 文 件 转 换 工 具 如 F etch 是 必 需 的 。 Fetch 可 以 通 过 e-mail申 请 （ Fetch@ dartmouth. edu) 免 费 获 得 用 于 非 商 业 用 途 而 像 Sequencher和 S w q M a n ， A B I 层 析 图 文 件 可 以 直 接 在 Macintosh电 脑 上 转 换 成 类 似 的 格 式 。 因 此 ， S e q M a n 和 Sequencher也 可 以 在 P C / W i n d o w s 平 台 下 运 行 。 备选方案使用A B I3700 D N A 分析仪进行96孔板/384孔板的大量测序 测序是确认常染色体显性遗传病和其他遗传病最敏感的一种方法。通常直接测序包( 含多个外显子的主要候选基因，通过这一方法对大量人群的D N A 进行扫描。 材 料 （ 标V 的项目参见附录1) 10 X 丁 ag 缓冲液，没有 M g C V (Roche) V "25mmol/L MgCl2 V I .25mmol/L 4d N T P 混合物 Spniol/p l寡核苷酸扩增引物 Tag D N A 聚合酶 J p/^ 聚 合 酶 （ Stratagene) T" t/i X L 3. 3X 缓 冲 液 （Applied biosystems， Roche) 25m m o l/L 乙酸镁溶液 T U X L D N A 聚 合 酶 （ Roche) 基因组D N A D N A 分子质量标记物 、 I U / ^ 碱性磷酸酶（ U S B ) lOU/pl外切核酸酶I (U S B ) 稀 释 缓 冲 液 （ Exo/ShrAP): 5 0 m m o l / L T r i s . C l ， p H 8. 0 5 X B i g D y e 稀 释 液 （Milli-Q系 列 超 纯 水 ， 过 滤 消 毒 ； AppliedBiosystems) : 在 MiUi-Q 系 列 超 纯 水 加 入 400mmol/L Tris •Cl 和 10mmol/L M g C l 2 ， p H 9 BigDye 终 止 子 序 歹 (1 分 析 盒 （Applied Biosystems) 96孔 或 384孔 P C R 平台 热控制/热循环
    P E R F O R M A D T R 96 孔 平 极 （Edge BioSystems) ABI 3700 D N A 自动化毛细管序列分析仪 1. 在冰上建立一个25/xlP C R 反应体系。用其中的一个反应体系。全部使用高保真性的 D N A 聚合酶混合物。 P C R 反应体系A : 2. 5|ul 10X T 叫缓冲液，没有MgCl2; 1.5jul25mmol/L MgCl2; 知1 I.25mmol/L 4dNTP (每个 dNTP 200pmol/L ); 2. 5jnl8pmol/jul 引 物 （ 最终 0 • 8/il); 0. 5〜0. 7U T 叫 D N A 聚合酶； '0.05〜0.07U P / w 聚合酶; 加 ddH20 至 25/^1。 P C R 反应体系B : 7. 5卩 1 T U X L 3. 3X 缓冲液； Ijul 25mmol/L 乙酸镁溶液； 知1 I.25mmol/L 4dNTP (每个 dNTP EOOjumol/U ; 2. 5卩 1 8pmol/jnl 引 物 （ 最终 0 • 8|Ltl ); 0. 25〜0. 5pl T 认 X L D N A 聚合酶（ Roche); ddH20 至 254。 最好的结果通常是完成200〜800b p 片段的扩增。 根据外显子和内含子交界处的50〜100碱基的位置确定引物。寡核苷酸引物的 大小通常是18〜25 个碱基。它有利于在变性时引物对温度<2。 (：。预计退火温度是 在 Tm 值以下5 C ，但是也要根据实验进行调整。 2.移取23/zl的反应物到96孔或者384孔 P C R 平台并包括50〜IOOng的 2/J/孔基因组 D N A (总体积244/孔）。 保持所有的试剂和样本都在冰 上 。 3. 简单离心。从冰上移取平台到热循环，预热到变性温度。用下列扩增循环执行P C R 。 初步： 2.5min 95 °C (初步变性) 3 5 个循环 20s 95〇C (变性) 30s 退火温度 (引物特异性结合) Imin 72 0C (延伸) 1 个循环 5min 停止并保存于4°C。 72 0C (最终延伸) 4. 取 P C R 产物的小样本通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度。用恰当的£^八分子 质量标记验证产物大小并估计浓度。假设每次序列反应每100b p 需 要 10〜15ng的 P C R 产物，从平台转移2〜5“ 的 P C R 产物到新的％ 孔或者384孔 P C R 平台提纯 和循环序列。 5 . 为了在P C R 的混合物中得到寡核苷酸和d N T P 准备下列的酶。准备过量反应所需要 的标准混合物（ 准备240/J 在 ％ 孔反应中） 。移取2jul酶到每个P C R 的反应体系中：
    〇.IjlJ 1U /V 碱性磷酸酶； 〇 • Ijul lOU/pd外切核酸酶I ; 1.8^稀释缓冲液。 6 . 简单的脉冲离心使残留液沿着管壁流下。替代P C R 管在热控制/热循环使用下列参数。 1 个 循 环 15min 37°C (酶孵化） 15min 80°C (酶热失活） 4°C (保存） 暂时保存样本于4°C 或者冻存于一20°C 直到序列分析。 7•为了纯化P C R 产物，直接独立加循环序列试剂或者作为一个准备的混合物（ 在这点 上 P C R 平台的无变化是必需的） 。集合试剂和扩大反应的数量。每个体系反应： 4〜7/J酶纯化的P C R 产物; 1〜2|ul测序引物（4〜8pmol，推荐4pmol); 2julBigDye 终止子； 6pi IX BigDye 稀释液； 加 ddH20 至 21/xl总体积。 避免BigDye试剂的过度曝光，因为这样会导致荧光信号的减弱。 选 择 成 对 的 测 序 引 物 ；每 当 P C R 引 物 不 能 得 到 预 期 结 果 的 时 候 就 需 要 设 计 引 物 。 当 P C R 产 物 非 常 长 或 者 质 量 很 差 （ 如 包 括 额 外 的 条 带 ）的 时 候 成 对 的 引 物 就 体 现 出 明 显 的 优 点 。 8 . 轻度离心使物质沉淀，置于热循环仪中，并按照以下参数运行热循环仪。 25个循环： IOs 96°C (快速切换温度） 5s 50°C (快速切换温度） 4min 60°C (快速切换温度） 快速切换温度至4°C ，待纯化。 9 . 纯化前，轻度离心平板，使物质沉降。根据生产商的使用说明，使用PERF〇 r m A D T R 96孔平板纯化循环测序产物。 1 0 . 在 80°C下干燥lh， 并存储在一20°C 下，分析前应避光（ 可存放3 周） 。在放入ABI 3700 D N A 毛细管测序仪前，应迅速用IOfJ 水重新悬浮。 1 1 . 获取A B I 层析图数据，并进行分析（ 基本方案，第 9 步） 。

    来源：丁香实验

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