单细胞mRNA差异显示实验

一、RNA 的分离

1. 收集对照组和实验组细胞，放入含 45ul2 mmol/L DTT 的 1.5 ml 微量离心管中。

2. 95℃ 水浴热解 2 min。

3. 每管加入以下物质：
   

4. 37℃ 温育 30 min。

5. 加以下物质：
   

6. 温育 37℃15 min。

7. 加 DEPC 处理过的 H2O 至终体积 200ul。

8. 加 200ul 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)。

9. 振荡 30s。

10. 微量离心机 14OOOg 离心 5 min。

11. 将上清转移到干净的 1.5 ml 管中，加 200ul 氯仿/异戊醇（24:1)。

12. 振荡 30s。

13. 微量离心机 14000 裒离心 2 min。

14. 加入 1ul(10ug）糖原，20ul3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 600ul 100% 乙醇,-20℃ 过夜沉淀 RNA。

    注意：在以下所沉淀步骤中不需要加糖原和过夜。

15. 在 4℃ 微量离心机中离心 14000 gX30 min。

16. 小心除去上清，加入 200ul 70% 乙醇。

17. 微量离心机短暂离心。

18. 小心除去上清液，室温下干燥沉淀物 5 min。

19. 按下一步骤的要求重溶解沉淀物。

    二、cDNA 的合成

    1.加入 10ul 经 DEPC 处理水重溶 RNA 沉淀物，加入 1ul（10ug）T7digo（dT)18。

    2.95℃ 水浴 2 min 使 RNA 变性，在冰上快速冷却。

    3.加以下物质：
    

    4.37℃ 温育 lh。

    5.加以下物质：
    

    6.16℃ 水浴温育 2 h。

    7.按上述 RNA 的分离第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    8.加入 10ul 水重溶双链 cDNA 沉淀物，用 50 ml TE 液（无 RNA 酶）透析 4 h(温和地将 cDNA 转移到 0.025um 微孔滤器上，滤器浮于含 50 ml 无 RNA 酶 TE 液的锥形管中。4 h 后将样本转移到 1.5 ml 的反应管中，用 5 经 DEPC 处理过水漂洗滤器，并将洗液加入同一管中)。

    三、aRNA 的合成

    1.每 15.2ul 上述步骤所得双链 cDNA 溶液中加入以下物质：
    

    2.37℃ 温育 4 h。

    3.加入以下物质：
    

    4.37°C 温育 30 min。

    5.按上述 RNA 的分离第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    四、从 aRNA 合成 cDNA

    1.加入 10ul 经 DEPC 处理水重溶 aRNA 沉淀物, 然后加入 1ul(10ng) 六核酸引物。

    2.95°C 水浴 2 min 使 aRNA 变性，在冰上决速冷却。

    3.加以下物质：
    

    4.37℃ 温育 lh。

    5.按上述 RNA 的分离的第 7~19 步进行酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提以及乙醇沉淀。

    6.按上述 cDNA 的合成的第 8 步进行透析。

    7.把 cDNA 转移到干净的反应管后，加入经 DEPC 处理水至终体积 50ul。

    五、DD-PCR

    1.在 0.5 ml 反应管中加入以下物质：
    
    

    2.当所用的热循环仪没有预热顶盖时，可以在反应管中加一滴植物油，以防止水分蒸发。

    3.将反应管放入预先加热到 94℃ 的热循环仪，进行 PCR 前先温育 3 min。

    4.循环 40 次。
    

    5.加 8pd 甲酰胺加样缓冲液，94°C,5 min 使 DNA 变性。

    6.5% 变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳，每孔加样 6ul 走胶，直至二甲苯青 FF 达凝胶全长的 3/4 处。

    7.用塑料薄片覆盖湿凝胶，无须固定，放射自显影过夜，用荧光墨水标记凝胶四角。

    8.利用突光点作为标志物准确排列经曝光胶片和凝胶，切下目的胶条，放入干净的 1.5 ml 反应管中。

    9.每个胶条中加 500 凝胶洗脱缓冲液，95℃ 水浴 10 min, 室温放置 16 h。

    10.取 200ul 含目的 PCR 产物的凝胶洗脱缓冲液，加入干净的 1.5 ml 反应管中，加 1ul(10ul）的糖原，按上述 RNA 的分离第 7~19 步沉淀 DNA。

    11.用 10ul 经 DEPC 处理水重溶 DNA 沉淀物。PCR 产物此时可在-20°C 储存，小部分样品（如 1~3ul) 可用于重新扩增（引物同 DD-PCR 反应）以及随后克隆或测序。重新扩增时 PCR 循环的次数严格根据初始 PCR 产物从聚丙烯酰凝胶中的回收率而定。一般来说，20~40 个循环可以获得足够的产物用于后续的克隆。我们推荐使用市售试剂盒来直接克隆经重新扩增的 PCR 产物，如 Invitrogen 公司的 TOPOTA 克隆试剂盒。

六、结果

我们已经用单细胞 mRNA 差异显示技术来鉴定参与软体动物两个已知神经元之间突触形成过程的基因（VanKesterenetaL1996)。靶细胞选定之后，发现神经元之间突触 联系的形成同时依赖于突触前以及突触后神经元的基因表达改变。知道这些变化的本质，对我们了解神经发育、神经元的可塑性以及神经系统的再生 IP 非常重要。因上述方法中包含 aRNA 扩增，这大大增加差异显示形式的可重复性。我们已经发现了 30 多个上调基因和下调基因（图 3-5)。目前正在对这些基因进行鉴定。