传统mRNA差异显示技术与第二代差异显示系统

研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（筛选）（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差异分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表达系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。

这里我们重点介绍 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）和第二代差异显示系统：限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）

传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR） 是根据绝大多数真核细胞mRNA3"端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5"-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。
原理见下图：
虽然mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在:
1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性;
2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因
3)得到的有差异的扩增条带短,一般在110～450bp之间；
4）以poly(A)为引物的PCR扩增只适合真核生物。
所以差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。第二代差异显示系统:限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是一个很有效的改进。
R FDD-PCR不是直接扩增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。正是RFDD-PCR系统使用了一系列特殊接头和引物，特异性PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性，解决了第一代差别显示系统的重复性问题；因为RFDD-PCR技术不使用以poly(A)为引物的PCR扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适用；在第一代的差异显示系统中，下游引物特异性结合poly(A)尾，因此与3"端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，而RFDD-PCR 采用优先切割翻译序列的 限制性内切酶 （如TaqI），因此可以优先展示编码区，更加适合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差异显示基因后，与disploy Fit网络相连后，可以确定哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因，对下一步研究有很好的知道意义。总之，RFDD-PCR中高度严谨的PCR可以产生结果一致的基因表达图谱，重点放大和展示编码区，对原核及真核RNA都有用，大大消除假阳性。原理见右图