原理
真核生物的mRNA 5’端有个帽子结构，3‘端有长约200 bp 的poly(A)尾巴。据此特点，可设计一种与其互补的序列oligo dT，为了把它锚定在poly（A）尾的起始端，将其设计成T12MN（M=A/C/G；N=A/T/C/G），这样T12MN 就有12 种不同的组合。将T12MN 作为反转录引物，就可以将带有poly（A）尾的mRNA 反转录为相应的cDNA，再用该引物锚定cDNA第二链的3′端，此时引入一随机引物进行PCR 扩增，由于随机引物随机结合在cDNA 的互补靶位点上，源于不同mRNA的扩增片段其大小不同，因此经过PCR 扩增的产物其大小也不同，通过电泳等技术显示在凝胶上，就可以检测到有差异的cDNA片段。经过验证其确实为特异片段，进而筛选cDNA文库或运用cDNA 末端的快速扩增（ Rapid Amplification of cDNA End，RACE）技术获得全长cDNA。
材料与仪器
18例脊索瘤及其周围正常组织(距肿瘤5cm以上)标本
琼脂糖 TBE电泳缓冲液 电泳载样缓冲液 溴化乙锭(EB)溶液母液 DNAGreen Trizol试剂
PCR仪 离心管 移液枪 枪头 枪头盒 水浴锅 自动凝胶电泳成像分析仪
琼脂糖 TBE电泳缓冲液 电泳载样缓冲液 溴化乙锭(EB)溶液母液 DNAGreen Trizol试剂
PCR仪 离心管 移液枪 枪头 枪头盒 水浴锅 自动凝胶电泳成像分析仪
步骤
一、 材料准备
1. 标本
18例脊索瘤及其周围正常组织(距肿瘤5 cm以上)标本来自中国医科大学附属第一、二医院、辽宁省人民医院、沈阳市中心医院骨科，经病理切片确诊为脊索瘤，取材后立即置于液氮中速冻，然后贮存于-7O℃冰箱中备用。本研究中mRNA-DD试
验所用标本编号为15，采自中国医科大学附属第一医院(2000-10-20)，60岁男性患者， 病理号为328874。
2. 引物
锚定引物(Anchored primer，HIEROGLYPH)：
T7(dT12)AP8 5 ACGACTCACTATAGGGCrITITTrrrrrIT丌AA3
T7(dT12)AP11 5 ACGACTCACTATAGGGCTT1Tn T 几TIrrAT3
随机引物(Arbitrary primer，HIEROGLYPH)：
M13r-ARP1： 5 ACAArITITCACACAGGACGACTCCAAG3
M 3r-ARP2：5 ACAArITITCACACAGGAGCTAGCATGG3
M13r-ARP3：5 ACAArITITCACACAGGAGACCATrGCA3
M13r-ARP4：5 ACAArITITCACACAGGAGATAGCAGAC3
二、 总RNA提取
应用Trizol试剂(GIBCOBRL)提取总RNA。
三、 反转录
取1 ug总RNA，应用GIBCOBRL的反转录试剂盒进行反转录，PCR反应体系20 ul，引物为1_7(dT12)APs，条件见试剂盒。
四、DD-PCR扩增
引物为M13r-ARPs，体系为10 ul，PCR扩增条件为：95℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 2 min，5个循环：95℃
30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，31个循环。
五、产物检测
取3 ul产物进行8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(50℃ ，3000 V，100 W，4～5 h)，GenomyxLRTM Fluores-cent Imaging Scanner扫描。然后将差异条带切下。
六、差异cDNA片段的纯化、测序、同源性比较与分析
差异条带重新进行PCR扩增， 扩增条件同DD-PCR，体系10.0 ul。将纯化的cDNA片段进行测序(上海生工生物工程技术公司)，测序结果在互联网上进行同源性比较和分析。
七、 差异cDNA片段的验证
根据两个差异cDNA片段的测序结果，分别设计一对特异引物(扩增507 bp和448 bp两个片段)，以相同脊索瘤患者的总RNA为模板，进行RT-PCR反应。两对特异引物的复性温度分别为58℃(cDNA1)和60℃(cDNA2)，引物序列如下：
cDNA 1：TCTGCCACATCTrGGCCrITITCAACCTCTGCTFCCCAGGCT
cDNA2：AACAGCCCTCAGCATrGGCTATGCCCAGATGGAGCCTCTC
内对照所用B-actin(318 bp)引物序列如下：
MW 5，ATCATGrITITGAGACCTCCAACA3
MW 5 CATCTCTFGCTCGAAGTCCA3
PCR反应条件：94℃ 30 s，58℃～60℃ 30 s，72℃1.5 min，35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳， 条件为80 V，60～90 min，自动凝胶电泳成像分析仪分析结果。
八、 差异cDNA片段与脊索瘤相关性的筛查
按照差异cDNA片段的验证实验所用方法，对剩余17例脊索瘤及其周围正常组织进行cDNA1和cDNA2两个差异片段的RT-PCR筛查。
注意事项
第二代是限制性酶切片段差异显示技术，也就是所谓的RFDD-PCR。限制性酶切片段差异显示（RFDD-PCR）就是对相对应liangpeng发明的传统ddrtpcr的很有效的改进。RFDD-PCR不是直接扩增cDNA，而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段两边加上特殊接头进行扩增。
常见问题
Sokolov等首次用琼脂糖凝胶电泳，EB呈色替代聚丙烯酰胺电泳和射自显影，使得工作大大简化。崔凯荣等对该方法加以改进，利用DD-PCR成功地得到3个在枸杞体细胞胚发生早期组织中基因特异表达的片段。
参考：韩壮， mRNA-DD法鉴定、筛查脊索瘤相关基因的实验研究，中国肿瘤临床，2005 , 32 (5) :287-289
参考：韩壮， mRNA-DD法鉴定、筛查脊索瘤相关基因的实验研究，中国肿瘤临床，2005 , 32 (5) :287-289
来源：丁香实验
