【资源分享】Neoprimer软件引物设计之我心得
丁香园论坛
1194
免费引物设计软件Neoprimer引物设计之我心得
最近听同学介绍了一款引物设计的软件——Neoprimer软件，融合引物设计的两个基本功能，即引物自动搜索和分析功能，并且使用方便，与Premier Primer相比有过之而无不及。现将我的心得讲述一下：打开序列后就能显示序列和限制性内切酶位点，然后在分析栏可以根据你的需要设计并搜索引物。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。可以用于搜索PCR引物，测序引物或杂交探针（包括上游引物，下游引物，或者引物对）。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，也可以在搜索时添加接头到5’端。引物搜索后，可以对得到的引物在分析栏上进行分析，有四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer），并且在下方同时显示PCR产物，由软件就能知道你所得产物的长度和大小。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。这些分析都可以很直观的在软件的下方得到，而可以不用作其他的操作，当然也可以通过其他方式进行查看。同时这些分析都总结性地显示了该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
使用该软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
根据我的经验，这个软件比单独使用“Premier Primer 5”软件和“Oligo 6“软件更方便，虽然Premier Primer 5”有强大的搜索功能，Oligo 6“软件又较好的分析功能，感觉Neoprimer软件集搜索和分析于一体了，用起非常方便，强烈推荐大家去试用一下。可以到http://noegen.com注册后打开邮箱激活后就可以免费下载安装使用，呵呵
最近听同学介绍了一款引物设计的软件——Neoprimer软件，融合引物设计的两个基本功能，即引物自动搜索和分析功能，并且使用方便，与Premier Primer相比有过之而无不及。现将我的心得讲述一下：打开序列后就能显示序列和限制性内切酶位点，然后在分析栏可以根据你的需要设计并搜索引物。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。可以用于搜索PCR引物，测序引物或杂交探针（包括上游引物，下游引物，或者引物对）。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，也可以在搜索时添加接头到5’端。引物搜索后，可以对得到的引物在分析栏上进行分析，有四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer），并且在下方同时显示PCR产物，由软件就能知道你所得产物的长度和大小。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。这些分析都可以很直观的在软件的下方得到，而可以不用作其他的操作，当然也可以通过其他方式进行查看。同时这些分析都总结性地显示了该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
使用该软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
根据我的经验，这个软件比单独使用“Premier Primer 5”软件和“Oligo 6“软件更方便，虽然Premier Primer 5”有强大的搜索功能，Oligo 6“软件又较好的分析功能，感觉Neoprimer软件集搜索和分析于一体了，用起非常方便，强烈推荐大家去试用一下。可以到http://noegen.com注册后打开邮箱激活后就可以免费下载安装使用，呵呵
