来谈谈引物设计软件OLIGO的使用方法及心得吧
丁香园论坛
3281
对于作PCR的来说，最难的莫过于设计引物了，理论现在已经很多了，但是真正实践起来是要付出一定的心智的，记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物，从没有失手的时候，真是让我佩服得五体投地。
最近看了一下OLIGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.
下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧：
1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一般扩展名为 .seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，可以从window菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。
2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗
3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔
4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾
5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所设计的引物与该模板不会形成错配，可在 And continue above search in other files 的条目前方格中打勾，这时会出现一个新的 select files窗，导入可能会形成错配的模板序列。点OK
6 点Search ranges按钮，输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物的长度，点OK
7 点parameters 即引物参数按钮，一般将搜索严谨性设为high，如果搜不到，再降低严谨性，另外，在adjust length to match Tm's前的方格中打勾。点OK
8 点击OK开始自动搜索
9 搜索完成后，在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK
10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序（sort)
11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE(Priming efficiency 引发效率）等。
12 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer 就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中，至于如何生成引物报告单我就不甚了了，感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。
Nested Primer pairs Search
与上述自动搜索差不多，有一下几点不同：
1 打开search菜单后，不要选定 “ And continue above search in other files ”
2 打开parameters菜单后，注意不要选定“ Inverse PCR” 框 ，同样选定“adjust length to match Tm's” 框
3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs"窗口中，从analyze菜单中 选定multiplexing,得到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在该窗口中选择您所要的引物，在您所要的引物的小方块上点击一下，positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色，negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物，然后选择一对内引物，选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口
4 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选定的引物导入到一个数据库中，保存。
好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了，这都大功告成了，到了最后又歇菜了。
还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的模板，比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧，我以为我已经找到了尚方宝剑了，可是三条序列试了一下，这三条序列经过 multiple align后有很长一段是保守的，您猜怎么着，等了好几分钟，结果没有找到，我又用十条序列，干脆就死机了，可能这一功能需要很大的内存才能使用。也许是我还没有找到窍门，有知道的还请教教我。
多谢了！！！
最近看了一下OLIGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.
下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧：
1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一般扩展名为 .seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，可以从window菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。
2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗
3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔
4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾
5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所设计的引物与该模板不会形成错配，可在 And continue above search in other files 的条目前方格中打勾，这时会出现一个新的 select files窗，导入可能会形成错配的模板序列。点OK
6 点Search ranges按钮，输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物的长度，点OK
7 点parameters 即引物参数按钮，一般将搜索严谨性设为high，如果搜不到，再降低严谨性，另外，在adjust length to match Tm's前的方格中打勾。点OK
8 点击OK开始自动搜索
9 搜索完成后，在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK
10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序（sort)
11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE(Priming efficiency 引发效率）等。
12 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer 就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中，至于如何生成引物报告单我就不甚了了，感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。
Nested Primer pairs Search
与上述自动搜索差不多，有一下几点不同：
1 打开search菜单后，不要选定 “ And continue above search in other files ”
2 打开parameters菜单后，注意不要选定“ Inverse PCR” 框 ，同样选定“adjust length to match Tm's” 框
3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs"窗口中，从analyze菜单中 选定multiplexing,得到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在该窗口中选择您所要的引物，在您所要的引物的小方块上点击一下，positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色，negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物，然后选择一对内引物，选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口
4 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选定的引物导入到一个数据库中，保存。
好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了，这都大功告成了，到了最后又歇菜了。
还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的模板，比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧，我以为我已经找到了尚方宝剑了，可是三条序列试了一下，这三条序列经过 multiple align后有很长一段是保守的，您猜怎么着，等了好几分钟，结果没有找到，我又用十条序列，干脆就死机了，可能这一功能需要很大的内存才能使用。也许是我还没有找到窍门，有知道的还请教教我。
多谢了！！！
