丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

人细胞因子引物资料、EMSA等可索取

丁香园论坛

2277
各位站友:
我于2002年开始进行一系列的SNP,人细胞因子RT-PCR检测和核因子-kappa B的EMSA检测,积累了一些资料和引物,目前仍在继续进行该类的研究。如有需要者可与我联系,我将随时赠送给真正需要者,并在赠送前都进行验证以确保引物能P出东东来。我的EMAIL:yubaojun1219@sohu.com
以下是我的研究结果和资料。请大家批评指正。
基因组DNA的提取:静脉全血2ml加0.5ml ACD(柠檬酸22.8 mM;柠檬酸钠45mM;葡萄糖74.2mM)缓冲液抗凝,用Promega公司提供的Wizard基因组DNA提取试剂盒提取DNA, DNA置 4C保存待测。
TNF alpha -308G/A (TNF1/TNF2)的检测:
上游引物5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’下游引物5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’,PCR参数:95C预变性2 min,进入35个循环:95C,1min; 56C,40 s; 72C,30 s。最终延伸72C,7 min。扩增含-308位点的片段107bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNF1/2的基因型,在电泳图上仅出现107bp,说明两等位基因均出现G到A的突变,为TNF2/2纯合子,无107bp而出现87bp和20bp两个特异性片段则为TNF1/1的纯合子,出现三个片段是TNF1/2杂合子。
-863C/A基因型的检测:上游引物5’-CCTGGGAGATATGGCCACACGT-3’ 下游引物5’-CTACATGGCCCTGTCTTCGTTACG-3’, PCR参数: 95C预变性2 min,进入35个循环:95C,40s; 56C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C,7 min。扩增含-863位点的片段150bp。经Tai I酶65C酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-863C/A的基因型,在电泳图上出现103、25、22bp,说明两等位基因均出现C到A的突变,为-863A/A纯合子,无103、25bp而出现128bp和22bp两个特异性片段则为-863C/C的纯合子,出现四个片段是-863C/A杂合子。
TNFB1/B2的检测:上游引物5’-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3’下游引物5’-AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC-3’PCR参数: 95C预变性2 min,进入35个循环:95C,1min; 56C, 40 s; 72C, 50 s。最终延伸72C,7 min。扩增含TNFB1/B2位点的片段782bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNFB1/B2的基因型,在电泳图上仅出现782bp,说明两等位基因均出现G到A的突变,为TNFB2/B2纯合子,无782bp而出现586bp和196bp两个特异性片段则为TNFB1/B1的纯合子,出现三个片段是TNFB1/B2杂合子。
IL-1 TaqIRFLP检测:合成PCR引物:上游引物: -GTTGTCATCAGACTTTGACC- ,下游引物: -TTCAGTTCATATGGACCAGA- 。该对引物可以扩增出第5外显子上,含TaqI酶切位点的基因片段249bp。PCR参数如下:选87℃预变性2min,后进入循环,97℃, 30s,55℃,30s,74℃,30s共35个循环;随后74℃最终延伸7 min。取5l PCR产物经TaqI酶切37℃消化4h后,进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据电泳条带大小判定基因类型。PCR片段径TaqI酶切后,如为Allele Ⅰ,则消化为135和114bp两条片段,如为Allele Ⅱ,则不能被酶切,仍为249bp。如为杂合子AlleleⅠ/Ⅱ。则电泳条带为249,135,114三个条带。本实验证实4h消化后Allele Ⅰ均能被酶切完全,不存在假阳性结果。
IL-10基因上-592C/A基因型的检测:上游引物:5’-CAACTTCTTCCACCCCATCTTT-3’下游引物:5’-GTGGGCTAAATATCCTCAAAGTT-3’;PCR参数: 95℃预变性2 min,35个循环:95℃,50s; 52℃, 50 s; 72℃, 50 s。最终延伸72℃,7 min。扩增片段477bp。
取5l PCR产物经Rsa I 37℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型:
C/C 311bp+116bp+42bp+8bp(特异性条带为311bp)
C/A 311bp+240bp+116bp+71bp+42bp+8bp
A/A 240bp+116bp+71bp+42bp+8bp(特异性条带为240bp)
IL-10 -1084 G/A基因型的检测:
上游引物:5’-CCA AGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3’下游引物:5’-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA- 3’。PCR参数: 95℃预变性2 min,35个循环:95℃,40s; 56℃, 40 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃,7 min。扩增片段377bp。
取5l PCR产物经Xag I 65℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型:
G/G 253bp+97bp+27bp(特异性条带为253bp)
G/A 280bp+253bp+97bp+27bp
A/A 280bp+97bp(特异性条带为280bp)
CD14基因-159C/T基因型检测:上游引物:5’-TGCCAGGAGACACAGAACCC-3’下游引物:5'-TGTCATTCAGTTCCCTCCTG-3’,PCR参数:96C预变性2 min,进入35个循环:96C,40s; 54C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C,7 min。扩增含-159位点的片段166bp。经HaeIII酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-159C/T的基因型,在电泳图上仅出现166bp,说明两等位基因均出现C到T的突变,为-159T/T纯合子,无166bp而被消化成较小的片段则为-159C/C的纯合子,出现含166又有酶切片段是-159C/T杂合子 。

单个核细胞的分离:空腹抽取外周全血,用ACD抗凝,小心加在同体积的淋巴细胞分离液上,以500g离心30 min。小心取出离心管,可见离心管中部有一水平的白色混浊区,用1ml移液器小心吸出中间层白色细胞,用PBS/EDTA缓冲液洗涤2次,用ACK缓冲液裂解残留的红细胞。以550g离心10min得到的细胞沉淀即为单个核细胞。用DMEM培养液悬浮,进行台盼兰排斥实验鉴定活力,细胞计数,调整细胞数总量约为1×107个,抽提核结合蛋白或总RNA。上述过程均在4℃条件下进行。
核蛋白提取方法(该方法可才用active motif 公司提供的核蛋白提取试剂盒进行,深圳晶美公司有售,注意细胞数量要达到10的7次方,低温、蛋白酶抑制、蛋白定量等)
取细胞悬液1ml(细胞数总量约为1×107个)高速(10,000~12,000g)离心5min,吸弃上清,用Buffer A [HEPES 10mM (在4C时pH7.9 )、氯化镁1.5mM、氯化钾10mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、DTT 0.5 mM和0.1%Triton X-100]悬浮细胞沉淀。用5ml注射器反复抽吸10次后使细胞膜完全破裂,置冰上10min。高速离心弃上清,用无Triton X-100的Buffer A洗涤离心5min×2次,离心后沉淀为细胞核。加Buffer C[HEPES 20 mM (在4C时pH 7.9), 甘油25%(v/v)、氯化钠420mM、氯化镁1.5 mM、EDTA 0.2 mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、和DTT 0.5mM]悬浮沉淀,裂解细胞核膜,置冰上40min,高速离心取上清,上清中含蛋白为细胞核蛋白。置-80℃冻存备用。用Bradford法行蛋白定量测定,标准品为牛血清蛋白。
DNA探针同位素标记:在灭菌Eppendorf管中加入如下试剂:2l 相应核转录因子特异性结合的双链DNA探针、1l T4 Polynucleotide Kinase 10× 缓冲液、1l [-32P]ATP(5,000~20,000cpm)(北京福瑞公司010-68215623)、5l Nuclease-free water、1l T4 Polynucleotide kinase,37C 孵育 10min 加入1l 0.5M EDTA 终止反应, 加89l TE 缓冲液,取少量测定探针结合百分率,标记了同位素的DNA探针置-80℃冻存。
EMSA法测定核蛋白中核转录因子蛋白活化水平(注意同位素的防护、干胶时无抽干机时可放置37度24-48H、洗片进放射科暗室进行)
按Promega公司Gel Shift Assay试剂盒方法去除未标记的探针后(按试剂盒要求进行),将标记的寡核苷酸探针与提取的核蛋白(1mg/ml的蛋白量)按下列步骤进行结合反应,
取250l的离心管,分别加如下试剂:
实验组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
提取的核蛋白 2l

阳性对照组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
Hela nuclear extract 2l
上述试剂加好后置室温下孵育10min,再分别加1l(5,000~20,000cpm)32P-ATP标记的NF-B寡核苷酸探针,室温放置20min,加Gel loading 10×buffer 1l。上4%非变性聚丙烯酰胺凝胶。
4%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
TBE 10×buffer 1.0ml
2%Bisacrylamide 0.5ml
40%Acrylamide 2.0ml
80%Glycerel 0.625ml
Distilled water 15.9ml
上述成分可按比例配制成500ml,置4C保存,用时直接取20.025ml,加TEMED和APS
TEMED 10l
10%APS 150l
垂直电泳槽装好后,用2%琼脂糖凝胶封好外周及两块玻板下方开口处,将配好的4%非变性聚丙烯酰胺约30ml灌入两块玻板间,室温放置1.5小时,拔取梳子,用TBE缓冲液稍冲洗点样孔,防止点样孔上未聚合的凝胶聚合于此,影响电泳条带的形状。100V预电泳0.5h。
吸取全部反应体系用微量加样器小心加入点样孔,100V电泳2h后小心取下凝胶,移到胶干燥滤纸上并用保鲜膜覆盖,真空干热抽干机在80C条件下抽干2h。将抽干后的薄膜固定于压片盒内,在暗室内将X光片放在薄膜上层,封好压片盒。置-80℃放射自显影24h,进行显影和定影。用扫描计算机对自显影条带进行密度扫描记录。
总RNA的抽提(不同试剂的操作类似,注意无酶环境、低温、勤换手套、冻存标本不宜过久,新鲜组织和细胞最好)
按Gibco公司提供的Trizol试剂操作步骤进行:将细胞悬液(细胞总数为1107个)以300g离心5min,彻底弃上清,加入1ml TRIZOL Reagent,立即用5ml注射器反复抽打5~10次。置室温30min,加入200l氯仿,用力颠倒离心管以混匀。 静置5min后,高速离心10min,离心速度为10,000~12,000g,(以下离心力同此)。小心将上层水相移至新的离心管中,加入500l异丙醇,振荡混匀,室温放置10min。离心5min,小心弃上清。在离心管中加入1ml 75%乙醇,振荡片刻后,以7,500g离心5min,小心弃上清。室温下静置15min使RNA沉淀恰好干燥,加入30-50l DEPC处理水溶解RNA,比色法测定RNA浓度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。总RNA样本保存于-80C。
RT-CR引物序列的设计和合成(以下引物均有剩余,都能做出理想的条带、GAPDH会有杂带但目的条带很工整)
引物均为参考文献已有,由上海申友公司合成。选用PROMEGA公司提供的一步法RT-PCR试剂盒。按试剂盒要求的步骤进行操作:基本反应条件如下具体参数根据引物Tm值和扩增片断的大小进行调整。
把AMV-RT逆转录酶和TflDNA聚合酶、AMV/Tfl反应缓冲液、dNTP混合液、硫酸镁、特异的上下游引物和RNA模板直接加入PCR反应管中。上PCR仪。
GAPDH mRNA表达的检测
上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
RT-PCR参数:48℃,45min;PCR参数: 94℃预变性2 min,35个循环:94℃,60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃,7 min。扩增片段452bp。
IL-1、mRNA表达的RT-PCR检测
合成RT-PCR引物:上游引物: -ATGGCAGAAGTACCTAAGCTCGR- 。
下游引物: -ACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGTT- , RT- PCR参数: 48℃,45min;94℃预变性2 min,进入35个循环:94℃,60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃,7 min。用promega公司Access RT-PCR系统,扩增片段802bp。
IL-10m RNA表达的检测
上游引物:5’-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3’
下游引物:5’-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3’RT-PCR参数如下: 48℃ ,45min; 94℃预变性2 min,进入35个循环:94℃,40s; 62℃, 50 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃,7 min。扩增片段328bp。
TNF-αmRNA表达水平的检测
上游引物:5’-ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG-3’
下游引物:5’-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCC-3’ 。RT-PCR参数: RT 48 °C 45min; 94°C预变性2 min,进入35个循环:94°C,60s; 60°C, 60 s; 72°C, 60 s。最终延伸72°C,7 min。扩增片段695bp 。细胞因子mRNA表达的水平经RT-PCR扩增后得到特定的片断,经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳1h后,用EB染色30min。经凝胶成像分析系统对电泳条带的灰度值进行计算,并与GAPDH相比,得出各细胞因子mRNA表达的相对强度,作为计量资料行统计学分析。

本人对上述资料的来源和可信度负责,如有意进行同类研究时出现问题我可提供帮助,欢迎合作,我有大量的时间和优越的环境来完成一些不太复杂的小课题。如需合作你只要动动电脑,给我来信就可。
多多探讨,有助于大家的进步和发展,也必然对这个网站有益,她的发展对我国医学科研才能起到更大的作用。
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序