人细胞因子引物资料、EMSA等可索取
丁香园论坛
2208
各位站友：
我于2002年开始进行一系列的SNP，人细胞因子RT-PCR检测和核因子-kappa B的EMSA检测，积累了一些资料和引物，目前仍在继续进行该类的研究。如有需要者可与我联系，我将随时赠送给真正需要者，并在赠送前都进行验证以确保引物能P出东东来。我的EMAIL：yubaojun1219@sohu.com
以下是我的研究结果和资料。请大家批评指正。
基因组DNA的提取：静脉全血2ml加0.5ml ACD(柠檬酸22.8 mM;柠檬酸钠45mM;葡萄糖74.2mM)缓冲液抗凝，用Promega公司提供的Wizard基因组DNA提取试剂盒提取DNA， DNA置 4C保存待测。
TNF alpha -308G/A (TNF1/TNF2)的检测：
上游引物5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’下游引物5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’，PCR参数：95C预变性2 min，进入35个循环：95C，1min; 56C,40 s; 72C,30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-308位点的片段107bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNF1/2的基因型，在电泳图上仅出现107bp，说明两等位基因均出现G到A的突变，为TNF2/2纯合子，无107bp而出现87bp和20bp两个特异性片段则为TNF1/1的纯合子，出现三个片段是TNF1/2杂合子。
-863C/A基因型的检测：上游引物5’-CCTGGGAGATATGGCCACACGT-3’ 下游引物5’-CTACATGGCCCTGTCTTCGTTACG-3’, PCR参数: 95C预变性2 min，进入35个循环：95C，40s; 56C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-863位点的片段150bp。经Tai I酶65C酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-863C/A的基因型，在电泳图上出现103、25、22bp，说明两等位基因均出现C到A的突变，为-863A/A纯合子，无103、25bp而出现128bp和22bp两个特异性片段则为-863C/C的纯合子，出现四个片段是-863C/A杂合子。
TNFB1/B2的检测：上游引物5’-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3’下游引物5’-AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC-3’PCR参数: 95C预变性2 min，进入35个循环：95C，1min; 56C, 40 s; 72C, 50 s。最终延伸72C，7 min。扩增含TNFB1/B2位点的片段782bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNFB1/B2的基因型，在电泳图上仅出现782bp，说明两等位基因均出现G到A的突变，为TNFB2/B2纯合子，无782bp而出现586bp和196bp两个特异性片段则为TNFB1/B1的纯合子，出现三个片段是TNFB1/B2杂合子。
IL-1 TaqIRFLP检测：合成PCR引物：上游引物： -GTTGTCATCAGACTTTGACC- ，下游引物： -TTCAGTTCATATGGACCAGA- 。该对引物可以扩增出第5外显子上，含TaqI酶切位点的基因片段249bp。PCR参数如下：选87℃预变性2min，后进入循环，97℃， 30s，55℃，30s，74℃，30s共35个循环；随后74℃最终延伸7 min。取5l PCR产物经TaqI酶切37℃消化4h后，进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳条带大小判定基因类型。PCR片段径TaqI酶切后，如为Allele Ⅰ，则消化为135和114bp两条片段，如为Allele Ⅱ，则不能被酶切，仍为249bp。如为杂合子AlleleⅠ/Ⅱ。则电泳条带为249，135，114三个条带。本实验证实4h消化后Allele Ⅰ均能被酶切完全，不存在假阳性结果。
IL-10基因上-592C/A基因型的检测：上游引物：5’-CAACTTCTTCCACCCCATCTTT-3’下游引物：5’-GTGGGCTAAATATCCTCAAAGTT-3’；PCR参数: 95℃预变性2 min，35个循环：95℃，50s; 52℃, 50 s; 72℃, 50 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段477bp。
取5l PCR产物经Rsa I 37℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型：
C/C 311bp+116bp+42bp+8bp(特异性条带为311bp)
C/A 311bp+240bp+116bp+71bp+42bp+8bp
A/A 240bp+116bp+71bp+42bp+8bp（特异性条带为240bp）
IL-10 -1084 G/A基因型的检测：
上游引物：5’-CCA AGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3’下游引物：5’-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA- 3’。PCR参数: 95℃预变性2 min，35个循环：95℃，40s; 56℃, 40 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段377bp。
取5l PCR产物经Xag I 65℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型：
G/G 253bp+97bp+27bp(特异性条带为253bp)
G/A 280bp+253bp+97bp+27bp
A/A 280bp+97bp(特异性条带为280bp)
CD14基因-159C/T基因型检测：上游引物：5’-TGCCAGGAGACACAGAACCC-3’下游引物：5'-TGTCATTCAGTTCCCTCCTG-3’，PCR参数：96C预变性2 min，进入35个循环：96C，40s; 54C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-159位点的片段166bp。经HaeIII酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-159C/T的基因型，在电泳图上仅出现166bp，说明两等位基因均出现C到T的突变，为-159T/T纯合子，无166bp而被消化成较小的片段则为-159C/C的纯合子，出现含166又有酶切片段是-159C/T杂合子 。
单个核细胞的分离：空腹抽取外周全血，用ACD抗凝，小心加在同体积的淋巴细胞分离液上，以500g离心30 min。小心取出离心管，可见离心管中部有一水平的白色混浊区，用1ml移液器小心吸出中间层白色细胞，用PBS/EDTA缓冲液洗涤2次，用ACK缓冲液裂解残留的红细胞。以550g离心10min得到的细胞沉淀即为单个核细胞。用DMEM培养液悬浮，进行台盼兰排斥实验鉴定活力，细胞计数，调整细胞数总量约为1×107个，抽提核结合蛋白或总RNA。上述过程均在4℃条件下进行。
核蛋白提取方法（该方法可才用active motif 公司提供的核蛋白提取试剂盒进行，深圳晶美公司有售，注意细胞数量要达到10的7次方，低温、蛋白酶抑制、蛋白定量等）
取细胞悬液1ml（细胞数总量约为1×107个）高速（10,000~12,000g）离心5min，吸弃上清，用Buffer A [HEPES 10mM (在4C时pH7.9 )、氯化镁1.5mM、氯化钾10mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、DTT 0.5 mM和0.1%Triton X-100]悬浮细胞沉淀。用5ml注射器反复抽吸10次后使细胞膜完全破裂，置冰上10min。高速离心弃上清，用无Triton X-100的Buffer A洗涤离心5min×2次，离心后沉淀为细胞核。加Buffer C[HEPES 20 mM (在4C时pH 7.9), 甘油25%(v/v)、氯化钠420mM、氯化镁1.5 mM、EDTA 0.2 mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、和DTT 0.5mM]悬浮沉淀，裂解细胞核膜，置冰上40min，高速离心取上清，上清中含蛋白为细胞核蛋白。置-80℃冻存备用。用Bradford法行蛋白定量测定，标准品为牛血清蛋白。
DNA探针同位素标记：在灭菌Eppendorf管中加入如下试剂：2l 相应核转录因子特异性结合的双链DNA探针、1l T4 Polynucleotide Kinase 10× 缓冲液、1l [-32P]ATP（5,000~20,000cpm）（北京福瑞公司010－68215623）、5l Nuclease-free water、1l T4 Polynucleotide kinase，37C 孵育 10min 加入1l 0.5M EDTA 终止反应， 加89l TE 缓冲液，取少量测定探针结合百分率，标记了同位素的DNA探针置-80℃冻存。
EMSA法测定核蛋白中核转录因子蛋白活化水平（注意同位素的防护、干胶时无抽干机时可放置37度24－48H、洗片进放射科暗室进行）
按Promega公司Gel Shift Assay试剂盒方法去除未标记的探针后（按试剂盒要求进行），将标记的寡核苷酸探针与提取的核蛋白（1mg/ml的蛋白量）按下列步骤进行结合反应，
取250l的离心管，分别加如下试剂：
实验组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
提取的核蛋白 2l
阳性对照组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
Hela nuclear extract 2l
上述试剂加好后置室温下孵育10min，再分别加1l（5,000~20,000cpm）32P-ATP标记的NF-B寡核苷酸探针，室温放置20min，加Gel loading 10×buffer 1l。上4％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
4％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
TBE 10×buffer 1.0ml
2%Bisacrylamide 0.5ml
40%Acrylamide 2.0ml
80%Glycerel 0.625ml
Distilled water 15.9ml
上述成分可按比例配制成500ml，置4C保存，用时直接取20.025ml，加TEMED和APS
TEMED 10l
10%APS 150l
垂直电泳槽装好后，用2%琼脂糖凝胶封好外周及两块玻板下方开口处，将配好的4%非变性聚丙烯酰胺约30ml灌入两块玻板间，室温放置1.5小时，拔取梳子，用TBE缓冲液稍冲洗点样孔，防止点样孔上未聚合的凝胶聚合于此，影响电泳条带的形状。100V预电泳0.5h。
吸取全部反应体系用微量加样器小心加入点样孔，100V电泳2h后小心取下凝胶，移到胶干燥滤纸上并用保鲜膜覆盖，真空干热抽干机在80C条件下抽干2h。将抽干后的薄膜固定于压片盒内，在暗室内将X光片放在薄膜上层，封好压片盒。置-80℃放射自显影24h，进行显影和定影。用扫描计算机对自显影条带进行密度扫描记录。
总RNA的抽提（不同试剂的操作类似，注意无酶环境、低温、勤换手套、冻存标本不宜过久，新鲜组织和细胞最好）
按Gibco公司提供的Trizol试剂操作步骤进行：将细胞悬液（细胞总数为1107个）以300g离心5min，彻底弃上清，加入1ml TRIZOL Reagent，立即用5ml注射器反复抽打5~10次。置室温30min，加入200l氯仿，用力颠倒离心管以混匀。 静置5min后，高速离心10min，离心速度为10，000~12，000g，（以下离心力同此）。小心将上层水相移至新的离心管中，加入500l异丙醇，振荡混匀，室温放置10min。离心5min，小心弃上清。在离心管中加入1ml 75%乙醇，振荡片刻后，以7，500g离心5min，小心弃上清。室温下静置15min使RNA沉淀恰好干燥，加入30-50l DEPC处理水溶解RNA，比色法测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。总RNA样本保存于-80C。
RT-CR引物序列的设计和合成（以下引物均有剩余，都能做出理想的条带、GAPDH会有杂带但目的条带很工整）
引物均为参考文献已有，由上海申友公司合成。选用PROMEGA公司提供的一步法RT－PCR试剂盒。按试剂盒要求的步骤进行操作：基本反应条件如下具体参数根据引物Tm值和扩增片断的大小进行调整。
把AMV－RT逆转录酶和TflDNA聚合酶、AMV/Tfl反应缓冲液、dNTP混合液、硫酸镁、特异的上下游引物和RNA模板直接加入PCR反应管中。上PCR仪。
GAPDH mRNA表达的检测
上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
RT-PCR参数：48℃，45min；PCR参数: 94℃预变性2 min，35个循环：94℃，60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段452bp。
IL-1、mRNA表达的RT-PCR检测
合成RT-PCR引物：上游引物： -ATGGCAGAAGTACCTAAGCTCGR- 。
下游引物： -ACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGTT- ， RT- PCR参数： 48℃，45min；94℃预变性2 min，进入35个循环：94℃，60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃，7 min。用promega公司Access RT-PCR系统，扩增片段802bp。
IL-10m RNA表达的检测
上游引物：5’-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3’
下游引物：5’-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3’RT-PCR参数如下： 48℃ ，45min； 94℃预变性2 min，进入35个循环：94℃，40s; 62℃, 50 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段328bp。
TNF-αmRNA表达水平的检测
上游引物：5’-ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG-3’
下游引物：5’-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCC-3’ 。RT-PCR参数： RT 48 °C 45min； 94°C预变性2 min，进入35个循环：94°C，60s; 60°C, 60 s; 72°C, 60 s。最终延伸72°C，7 min。扩增片段695bp 。细胞因子mRNA表达的水平经RT-PCR扩增后得到特定的片断，经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳1h后，用EB染色30min。经凝胶成像分析系统对电泳条带的灰度值进行计算，并与GAPDH相比，得出各细胞因子mRNA表达的相对强度，作为计量资料行统计学分析。
本人对上述资料的来源和可信度负责，如有意进行同类研究时出现问题我可提供帮助，欢迎合作，我有大量的时间和优越的环境来完成一些不太复杂的小课题。如需合作你只要动动电脑，给我来信就可。
多多探讨，有助于大家的进步和发展，也必然对这个网站有益，她的发展对我国医学科研才能起到更大的作用。
我于2002年开始进行一系列的SNP，人细胞因子RT-PCR检测和核因子-kappa B的EMSA检测，积累了一些资料和引物，目前仍在继续进行该类的研究。如有需要者可与我联系，我将随时赠送给真正需要者，并在赠送前都进行验证以确保引物能P出东东来。我的EMAIL：yubaojun1219@sohu.com
以下是我的研究结果和资料。请大家批评指正。
基因组DNA的提取：静脉全血2ml加0.5ml ACD(柠檬酸22.8 mM;柠檬酸钠45mM;葡萄糖74.2mM)缓冲液抗凝，用Promega公司提供的Wizard基因组DNA提取试剂盒提取DNA， DNA置 4C保存待测。
TNF alpha -308G/A (TNF1/TNF2)的检测：
上游引物5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’下游引物5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’，PCR参数：95C预变性2 min，进入35个循环：95C，1min; 56C,40 s; 72C,30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-308位点的片段107bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNF1/2的基因型，在电泳图上仅出现107bp，说明两等位基因均出现G到A的突变，为TNF2/2纯合子，无107bp而出现87bp和20bp两个特异性片段则为TNF1/1的纯合子，出现三个片段是TNF1/2杂合子。
-863C/A基因型的检测：上游引物5’-CCTGGGAGATATGGCCACACGT-3’ 下游引物5’-CTACATGGCCCTGTCTTCGTTACG-3’, PCR参数: 95C预变性2 min，进入35个循环：95C，40s; 56C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-863位点的片段150bp。经Tai I酶65C酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-863C/A的基因型，在电泳图上出现103、25、22bp，说明两等位基因均出现C到A的突变，为-863A/A纯合子，无103、25bp而出现128bp和22bp两个特异性片段则为-863C/C的纯合子，出现四个片段是-863C/A杂合子。
TNFB1/B2的检测：上游引物5’-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3’下游引物5’-AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC-3’PCR参数: 95C预变性2 min，进入35个循环：95C，1min; 56C, 40 s; 72C, 50 s。最终延伸72C，7 min。扩增含TNFB1/B2位点的片段782bp。经Nco I酶切4h 后可根据特异性片段来判定TNFB1/B2的基因型，在电泳图上仅出现782bp，说明两等位基因均出现G到A的突变，为TNFB2/B2纯合子，无782bp而出现586bp和196bp两个特异性片段则为TNFB1/B1的纯合子，出现三个片段是TNFB1/B2杂合子。
IL-1 TaqIRFLP检测：合成PCR引物：上游引物： -GTTGTCATCAGACTTTGACC- ，下游引物： -TTCAGTTCATATGGACCAGA- 。该对引物可以扩增出第5外显子上，含TaqI酶切位点的基因片段249bp。PCR参数如下：选87℃预变性2min，后进入循环，97℃， 30s，55℃，30s，74℃，30s共35个循环；随后74℃最终延伸7 min。取5l PCR产物经TaqI酶切37℃消化4h后，进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳条带大小判定基因类型。PCR片段径TaqI酶切后，如为Allele Ⅰ，则消化为135和114bp两条片段，如为Allele Ⅱ，则不能被酶切，仍为249bp。如为杂合子AlleleⅠ/Ⅱ。则电泳条带为249，135，114三个条带。本实验证实4h消化后Allele Ⅰ均能被酶切完全，不存在假阳性结果。
IL-10基因上-592C/A基因型的检测：上游引物：5’-CAACTTCTTCCACCCCATCTTT-3’下游引物：5’-GTGGGCTAAATATCCTCAAAGTT-3’；PCR参数: 95℃预变性2 min，35个循环：95℃，50s; 52℃, 50 s; 72℃, 50 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段477bp。
取5l PCR产物经Rsa I 37℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型：
C/C 311bp+116bp+42bp+8bp(特异性条带为311bp)
C/A 311bp+240bp+116bp+71bp+42bp+8bp
A/A 240bp+116bp+71bp+42bp+8bp（特异性条带为240bp）
IL-10 -1084 G/A基因型的检测：
上游引物：5’-CCA AGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3’下游引物：5’-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA- 3’。PCR参数: 95℃预变性2 min，35个循环：95℃，40s; 56℃, 40 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段377bp。
取5l PCR产物经Xag I 65℃酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定基因型：
G/G 253bp+97bp+27bp(特异性条带为253bp)
G/A 280bp+253bp+97bp+27bp
A/A 280bp+97bp(特异性条带为280bp)
CD14基因-159C/T基因型检测：上游引物：5’-TGCCAGGAGACACAGAACCC-3’下游引物：5'-TGTCATTCAGTTCCCTCCTG-3’，PCR参数：96C预变性2 min，进入35个循环：96C，40s; 54C, 40 s; 72C, 30 s。最终延伸72C，7 min。扩增含-159位点的片段166bp。经HaeIII酶切 4h 后,可根据特异性片段来判定-159C/T的基因型，在电泳图上仅出现166bp，说明两等位基因均出现C到T的突变，为-159T/T纯合子，无166bp而被消化成较小的片段则为-159C/C的纯合子，出现含166又有酶切片段是-159C/T杂合子 。
单个核细胞的分离：空腹抽取外周全血，用ACD抗凝，小心加在同体积的淋巴细胞分离液上，以500g离心30 min。小心取出离心管，可见离心管中部有一水平的白色混浊区，用1ml移液器小心吸出中间层白色细胞，用PBS/EDTA缓冲液洗涤2次，用ACK缓冲液裂解残留的红细胞。以550g离心10min得到的细胞沉淀即为单个核细胞。用DMEM培养液悬浮，进行台盼兰排斥实验鉴定活力，细胞计数，调整细胞数总量约为1×107个，抽提核结合蛋白或总RNA。上述过程均在4℃条件下进行。
核蛋白提取方法（该方法可才用active motif 公司提供的核蛋白提取试剂盒进行，深圳晶美公司有售，注意细胞数量要达到10的7次方，低温、蛋白酶抑制、蛋白定量等）
取细胞悬液1ml（细胞数总量约为1×107个）高速（10,000~12,000g）离心5min，吸弃上清，用Buffer A [HEPES 10mM (在4C时pH7.9 )、氯化镁1.5mM、氯化钾10mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、DTT 0.5 mM和0.1%Triton X-100]悬浮细胞沉淀。用5ml注射器反复抽吸10次后使细胞膜完全破裂，置冰上10min。高速离心弃上清，用无Triton X-100的Buffer A洗涤离心5min×2次，离心后沉淀为细胞核。加Buffer C[HEPES 20 mM (在4C时pH 7.9), 甘油25%(v/v)、氯化钠420mM、氯化镁1.5 mM、EDTA 0.2 mM、PMSF 0.2mM、Leupeptin 0.2mM、Aprotinin 15mU/ml、和DTT 0.5mM]悬浮沉淀，裂解细胞核膜，置冰上40min，高速离心取上清，上清中含蛋白为细胞核蛋白。置-80℃冻存备用。用Bradford法行蛋白定量测定，标准品为牛血清蛋白。
DNA探针同位素标记：在灭菌Eppendorf管中加入如下试剂：2l 相应核转录因子特异性结合的双链DNA探针、1l T4 Polynucleotide Kinase 10× 缓冲液、1l [-32P]ATP（5,000~20,000cpm）（北京福瑞公司010－68215623）、5l Nuclease-free water、1l T4 Polynucleotide kinase，37C 孵育 10min 加入1l 0.5M EDTA 终止反应， 加89l TE 缓冲液，取少量测定探针结合百分率，标记了同位素的DNA探针置-80℃冻存。
EMSA法测定核蛋白中核转录因子蛋白活化水平（注意同位素的防护、干胶时无抽干机时可放置37度24－48H、洗片进放射科暗室进行）
按Promega公司Gel Shift Assay试剂盒方法去除未标记的探针后（按试剂盒要求进行），将标记的寡核苷酸探针与提取的核蛋白（1mg/ml的蛋白量）按下列步骤进行结合反应，
取250l的离心管，分别加如下试剂：
实验组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
提取的核蛋白 2l
阳性对照组
gel shift binding 5×buffer 2l
Nuclease free water 5l
Hela nuclear extract 2l
上述试剂加好后置室温下孵育10min，再分别加1l（5,000~20,000cpm）32P-ATP标记的NF-B寡核苷酸探针，室温放置20min，加Gel loading 10×buffer 1l。上4％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
4％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
TBE 10×buffer 1.0ml
2%Bisacrylamide 0.5ml
40%Acrylamide 2.0ml
80%Glycerel 0.625ml
Distilled water 15.9ml
上述成分可按比例配制成500ml，置4C保存，用时直接取20.025ml，加TEMED和APS
TEMED 10l
10%APS 150l
垂直电泳槽装好后，用2%琼脂糖凝胶封好外周及两块玻板下方开口处，将配好的4%非变性聚丙烯酰胺约30ml灌入两块玻板间，室温放置1.5小时，拔取梳子，用TBE缓冲液稍冲洗点样孔，防止点样孔上未聚合的凝胶聚合于此，影响电泳条带的形状。100V预电泳0.5h。
吸取全部反应体系用微量加样器小心加入点样孔，100V电泳2h后小心取下凝胶，移到胶干燥滤纸上并用保鲜膜覆盖，真空干热抽干机在80C条件下抽干2h。将抽干后的薄膜固定于压片盒内，在暗室内将X光片放在薄膜上层，封好压片盒。置-80℃放射自显影24h，进行显影和定影。用扫描计算机对自显影条带进行密度扫描记录。
总RNA的抽提（不同试剂的操作类似，注意无酶环境、低温、勤换手套、冻存标本不宜过久，新鲜组织和细胞最好）
按Gibco公司提供的Trizol试剂操作步骤进行：将细胞悬液（细胞总数为1107个）以300g离心5min，彻底弃上清，加入1ml TRIZOL Reagent，立即用5ml注射器反复抽打5~10次。置室温30min，加入200l氯仿，用力颠倒离心管以混匀。 静置5min后，高速离心10min，离心速度为10，000~12，000g，（以下离心力同此）。小心将上层水相移至新的离心管中，加入500l异丙醇，振荡混匀，室温放置10min。离心5min，小心弃上清。在离心管中加入1ml 75%乙醇，振荡片刻后，以7，500g离心5min，小心弃上清。室温下静置15min使RNA沉淀恰好干燥，加入30-50l DEPC处理水溶解RNA，比色法测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。总RNA样本保存于-80C。
RT-CR引物序列的设计和合成（以下引物均有剩余，都能做出理想的条带、GAPDH会有杂带但目的条带很工整）
引物均为参考文献已有，由上海申友公司合成。选用PROMEGA公司提供的一步法RT－PCR试剂盒。按试剂盒要求的步骤进行操作：基本反应条件如下具体参数根据引物Tm值和扩增片断的大小进行调整。
把AMV－RT逆转录酶和TflDNA聚合酶、AMV/Tfl反应缓冲液、dNTP混合液、硫酸镁、特异的上下游引物和RNA模板直接加入PCR反应管中。上PCR仪。
GAPDH mRNA表达的检测
上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
RT-PCR参数：48℃，45min；PCR参数: 94℃预变性2 min，35个循环：94℃，60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段452bp。
IL-1、mRNA表达的RT-PCR检测
合成RT-PCR引物：上游引物： -ATGGCAGAAGTACCTAAGCTCGR- 。
下游引物： -ACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGTT- ， RT- PCR参数： 48℃，45min；94℃预变性2 min，进入35个循环：94℃，60s; 60℃, 60 s; 72℃, 60 s。最终延伸72℃，7 min。用promega公司Access RT-PCR系统，扩增片段802bp。
IL-10m RNA表达的检测
上游引物：5’-AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCG-3’
下游引物：5’-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGATTTTGG-3’RT-PCR参数如下： 48℃ ，45min； 94℃预变性2 min，进入35个循环：94℃，40s; 62℃, 50 s; 72℃, 40 s。最终延伸72℃，7 min。扩增片段328bp。
TNF-αmRNA表达水平的检测
上游引物：5’-ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG-3’
下游引物：5’-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCC-3’ 。RT-PCR参数： RT 48 °C 45min； 94°C预变性2 min，进入35个循环：94°C，60s; 60°C, 60 s; 72°C, 60 s。最终延伸72°C，7 min。扩增片段695bp 。细胞因子mRNA表达的水平经RT-PCR扩增后得到特定的片断，经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳1h后，用EB染色30min。经凝胶成像分析系统对电泳条带的灰度值进行计算，并与GAPDH相比，得出各细胞因子mRNA表达的相对强度，作为计量资料行统计学分析。
本人对上述资料的来源和可信度负责，如有意进行同类研究时出现问题我可提供帮助，欢迎合作，我有大量的时间和优越的环境来完成一些不太复杂的小课题。如需合作你只要动动电脑，给我来信就可。
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