我的总RNA提取到底出了什么问题?
丁香园
1272
玻璃器具、研钵处理方法：
洗洁精洗后自来水冲7遍，双蒸水冲3次，60℃烤干，泡酸过夜后自来水冲7遍，双蒸水冲3次。烤干，150℃烤4小时。
枪头、EP管等处理方法：
0.1%DEPC溶液浸泡过夜，取出高压灭活DEPC 15分钟。
实验用水：
均用0.02%DEPC处理水配制。0.02%DEPC处理水配制方法：配0.02%DEPC水溶液，15Psi高压15分钟。
组织处理：迅速取出称取100mg，放入1.5 ml EP管中（未处理），置-70℃保存。
提取方法：
1. 将组织取出，在-20℃预冷的研钵中冰浴研碎，1mlTRIZOL将组织冲洗入DEPC处理1.5mlEP管中，室温5分钟。或直接将1mlTRIZOL加入预冷玻璃匀浆器中，冰浴中匀浆后将匀浆液转到EP管。
2. 加0.2ml 氯仿，用力摇15秒后，室温3分钟。
3. 12000g 室温离心10分钟。
4. 将水样层转移到另一干净EP管中。
5. 加0.5ml 异丙醇，室温10分钟。
6. 12000g 室温离心10分钟，倾去上清，加1ml 75% 乙醇。
7. 7500 g离心5分钟，吸去上清，自然干燥10分钟。
8. 加40微升DEPC处理水溶解。
9. 58℃温育10分钟促其溶解。
10. 取10微升，溶于2ml TE 缓冲液中，以TE为空白对照，测A260/A280。通常测出A260/A280为1，有时更小。
11. 取8微升，加2微升上样缓冲液，于1.5% 琼脂糖凝胶中 150V 电泳10分钟至半小时（undefinedTBE电泳缓冲液）。结果只可见5S带。
因为不成功,所以我重新处理了实验用器具并重新配制了所有试剂,(氯仿和异丙醇没有重新处理).但情况还是一样.
因为取出组织我没有经过液氮速冻,而是直接放在-70度冰箱中,我想是不是样品保存条件不好,所以我又将新鲜组织取出后立即置于TRIZOL中匀浆,结果和以前一样.
于是我怀疑是不是TRIZOL有问题,在医院检验科要了一个小包装的丙肝RT-PCR试剂盒的单相裂解液重复了一次,还是不成功.仍是只见5S带.
现在我真的是想不出来还有什么问题了.xx(:?):?)
洗洁精洗后自来水冲7遍，双蒸水冲3次，60℃烤干，泡酸过夜后自来水冲7遍，双蒸水冲3次。烤干，150℃烤4小时。
枪头、EP管等处理方法：
0.1%DEPC溶液浸泡过夜，取出高压灭活DEPC 15分钟。
实验用水：
均用0.02%DEPC处理水配制。0.02%DEPC处理水配制方法：配0.02%DEPC水溶液，15Psi高压15分钟。
组织处理：迅速取出称取100mg，放入1.5 ml EP管中（未处理），置-70℃保存。
提取方法：
1. 将组织取出，在-20℃预冷的研钵中冰浴研碎，1mlTRIZOL将组织冲洗入DEPC处理1.5mlEP管中，室温5分钟。或直接将1mlTRIZOL加入预冷玻璃匀浆器中，冰浴中匀浆后将匀浆液转到EP管。
2. 加0.2ml 氯仿，用力摇15秒后，室温3分钟。
3. 12000g 室温离心10分钟。
4. 将水样层转移到另一干净EP管中。
5. 加0.5ml 异丙醇，室温10分钟。
6. 12000g 室温离心10分钟，倾去上清，加1ml 75% 乙醇。
7. 7500 g离心5分钟，吸去上清，自然干燥10分钟。
8. 加40微升DEPC处理水溶解。
9. 58℃温育10分钟促其溶解。
10. 取10微升，溶于2ml TE 缓冲液中，以TE为空白对照，测A260/A280。通常测出A260/A280为1，有时更小。
11. 取8微升，加2微升上样缓冲液，于1.5% 琼脂糖凝胶中 150V 电泳10分钟至半小时（undefinedTBE电泳缓冲液）。结果只可见5S带。
因为不成功,所以我重新处理了实验用器具并重新配制了所有试剂,(氯仿和异丙醇没有重新处理).但情况还是一样.
因为取出组织我没有经过液氮速冻,而是直接放在-70度冰箱中,我想是不是样品保存条件不好,所以我又将新鲜组织取出后立即置于TRIZOL中匀浆,结果和以前一样.
于是我怀疑是不是TRIZOL有问题,在医院检验科要了一个小包装的丙肝RT-PCR试剂盒的单相裂解液重复了一次,还是不成功.仍是只见5S带.
现在我真的是想不出来还有什么问题了.xx(:?):?)
