【分享】RT-PCR 经验之我谈
丁香园论坛
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看到论坛上有很多朋友询问RT-PCR的重复性问题，说明这里面还是有很多问题的，于是 想跟大家分享一下自己做PCR的经验：
1. 总RNA的提取： 材料来源一般为细胞和组织，细胞相对比较单一，蛋白污染较小，TRIZOL法提取结果 A260/A280 结果一般都在1.8-2.1之间；组织的成分较复杂，污染多，提取较纯的RNA有一定难度, 我觉得以下地方需注意：
1）最好新鲜取材，不能马上做的标本可以-70度保存，短时间内也不会有什么影响。
2）研磨的手法一定要正确，如果不能彻底把组织研碎（肉眼观看无颗粒），很可能会影响你RNA的浓度，50-100mg的组织提取的RNA用20ul水稀释后应该有2-4ug/ul 的浓度，当然最好在冰上研磨，这样可以防止RNA的降解，但是我在常温下做，好像浓度也不差。
3）加氯坊离心后上清不能吸太多，宁缺勿滥，一般吸上清的1/2,最好不超过2/3 ，我一般吸200-300ul 觉得就可以了。
其实RT-PCR对RNA的要求不是很高的，电泳不能跑出两条带也没关系，逆转录后照样可以p出来，因为PCR还是相当灵敏的，很少的模板链就可以了，所以只要RNA降解得不是太厉害就没关系。这样的RNA应该可以往下做： A260在 0.1-1.4之间 ，A260/A280 在1.7-2.0 之间，浓度在 1.5-5.0之间。
2.逆转录。 逆转录的技术我觉得较成熟，一般的mRNA加oligo（dt）和逆转录酶都可以做出来，我用小公司的试剂盒做都比较稳定，更不用说invitrogen和TAKARA等大公司了。
3. PCR . 这是个很精细的体系，酶 ， dNTP ，Mg的浓度适中才能达到最好的效果，有人说PCR不能像炒菜那样，喜欢多放点盐就多放点，喜欢多放点油就多放点，PCR对成分很在乎，这就是PCR难重复的原因，如果总体系少于25ul ，各种成分的量就更不好控制，因为0.3ul ，0.5ul ，本身加样的时候误差就很大，所以少于25ul的体系就难重复了。
1) 模板cDNA ，20ul 的逆转录体系取1-2ul足够，我一般取2ul。
2）dNTP ，标准的PCR体系有dNTP的浓度，换算过来加上所需的体积。
3）Taq 酶 ，50ul的总体系加1ul足够。
4）buffer ，有些buffer里含有Mg离子，自己换算一下，让最后的Mg离子浓度能在1.5左右。
5）不含Mg的buffer要单加Mg
6）上下游引物 ，一般自己把引物公司合成的引物稀释成10pmol/ul，1-2ul即可，因为标准的PCR体系需要10-100pmol 。
7）余下成分用水补平。
本人觉得影响pcr最大的因素是： Mg 浓度，退火温度 ，循环数 ，其中Mg浓度为重中之重，有时候甚至有点苛刻， 浓度过高抑制taq酶，过低taq酶没用，就像那个谁形容的美女，多一分则太肥,少一分又太瘦 。所以建议做个梯度 ，找到最适浓度。 退火温度嘛，应该好摸，一般的实验室都有梯度PCR仪的，至于循环数 ，30-40个，试情况自己定。 这些东西关键是自己摸，多摸几个，不用十八摸那么夸张，七八摸应该就可以出来了。
纯属个人观点，希望对大家有点帮助，并欢迎指正。
1. 总RNA的提取： 材料来源一般为细胞和组织，细胞相对比较单一，蛋白污染较小，TRIZOL法提取结果 A260/A280 结果一般都在1.8-2.1之间；组织的成分较复杂，污染多，提取较纯的RNA有一定难度, 我觉得以下地方需注意：
1）最好新鲜取材，不能马上做的标本可以-70度保存，短时间内也不会有什么影响。
2）研磨的手法一定要正确，如果不能彻底把组织研碎（肉眼观看无颗粒），很可能会影响你RNA的浓度，50-100mg的组织提取的RNA用20ul水稀释后应该有2-4ug/ul 的浓度，当然最好在冰上研磨，这样可以防止RNA的降解，但是我在常温下做，好像浓度也不差。
3）加氯坊离心后上清不能吸太多，宁缺勿滥，一般吸上清的1/2,最好不超过2/3 ，我一般吸200-300ul 觉得就可以了。
其实RT-PCR对RNA的要求不是很高的，电泳不能跑出两条带也没关系，逆转录后照样可以p出来，因为PCR还是相当灵敏的，很少的模板链就可以了，所以只要RNA降解得不是太厉害就没关系。这样的RNA应该可以往下做： A260在 0.1-1.4之间 ，A260/A280 在1.7-2.0 之间，浓度在 1.5-5.0之间。
2.逆转录。 逆转录的技术我觉得较成熟，一般的mRNA加oligo（dt）和逆转录酶都可以做出来，我用小公司的试剂盒做都比较稳定，更不用说invitrogen和TAKARA等大公司了。
3. PCR . 这是个很精细的体系，酶 ， dNTP ，Mg的浓度适中才能达到最好的效果，有人说PCR不能像炒菜那样，喜欢多放点盐就多放点，喜欢多放点油就多放点，PCR对成分很在乎，这就是PCR难重复的原因，如果总体系少于25ul ，各种成分的量就更不好控制，因为0.3ul ，0.5ul ，本身加样的时候误差就很大，所以少于25ul的体系就难重复了。
1) 模板cDNA ，20ul 的逆转录体系取1-2ul足够，我一般取2ul。
2）dNTP ，标准的PCR体系有dNTP的浓度，换算过来加上所需的体积。
3）Taq 酶 ，50ul的总体系加1ul足够。
4）buffer ，有些buffer里含有Mg离子，自己换算一下，让最后的Mg离子浓度能在1.5左右。
5）不含Mg的buffer要单加Mg
6）上下游引物 ，一般自己把引物公司合成的引物稀释成10pmol/ul，1-2ul即可，因为标准的PCR体系需要10-100pmol 。
7）余下成分用水补平。
本人觉得影响pcr最大的因素是： Mg 浓度，退火温度 ，循环数 ，其中Mg浓度为重中之重，有时候甚至有点苛刻， 浓度过高抑制taq酶，过低taq酶没用，就像那个谁形容的美女，多一分则太肥,少一分又太瘦 。所以建议做个梯度 ，找到最适浓度。 退火温度嘛，应该好摸，一般的实验室都有梯度PCR仪的，至于循环数 ，30-40个，试情况自己定。 这些东西关键是自己摸，多摸几个，不用十八摸那么夸张，七八摸应该就可以出来了。
纯属个人观点，希望对大家有点帮助，并欢迎指正。
