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【分享】RT-PCR 经验之我谈

丁香实验

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看到论坛上有很多朋友询问 RT-PCR 的重复性问题,说明这里面还是有很多问题的,于是想跟大家分享一下自己做 PCR 的经验:


1. 总 RNA 的提取

材料来源一般为细胞和组织,细胞相对比较单一,蛋白污染较小,TRIZOL 法提取结果 A260/A280 结果一般都在 1.8-2.1 之间;组织的成分较复杂,污染多,提取较纯的 RNA 有一定难度, 我觉得以下地方需注意:

1)最好新鲜取材,不能马上做的标本可以 -70 度保存,短时间内也不会有什么影响。

2)研磨的手法一定要正确,如果不能彻底把组织研碎(肉眼观看无颗粒),很可能会影响你 RNA 的浓度,50-100mg 的组织提取的 RNA 用 20ul 水稀释后应该有 2-4ug/ul 的浓度,当然最好在冰上研磨,这样可以防止 RNA 的降解,但是我在常温下做,好像浓度也不差。

3)加氯坊离心后上清不能吸太多,宁缺勿滥,一般吸上清的 1/2,最好不超过 2/3 ,我一般吸 200-300ul 觉得就可以了。

其实 RT-PCR 对 RNA 的要求不是很高的,电泳不能跑出两条带也没关系,逆转录后照样可以 p 出来,因为PCR还是相当灵敏的,很少的模板链就可以了,所以只要RNA降解得不是太厉害就没关系。这样的 RNA应该可以往下做: A260 在 0.1-1.4之间 ,A260/A280 在1.7-2.0 之间,浓度在 1.5-5.0之间。


2.逆转录

逆转录的技术我觉得较成熟,一般的 mRNA 加 oligo(dt)和逆转录酶都可以做出来,我用小公司的试剂盒做都比较稳定,更不用说 invitrogen 和 TAKARA 等大公司了。

3. PCR

这是个很精细的体系,酶 , dNTP ,Mg 的浓度适中才能达到最好的效果,有人说 PCR 不能像炒菜那样,喜欢多放点盐就多放点,喜欢多放点油就多放点,PCR 对成分很在乎,这就是 PCR 难重复的原因,如果总体系少于 25ul ,各种成分的量就更不好控制,因为 0.3ul ,0.5ul ,本身加样的时候误差就很大,所以少于 25ul 的体系就难重复了。

1) 模板 cDNA ,20ul 的逆转录体系取 1-2ul 足够,我一般取 2ul。

2)dNTP ,标准的 PCR 体系有 dNTP 的浓度,换算过来加上所需的体积。

3)Taq 酶 ,50ul 的总体系加 1ul 足够。

4)buffer ,有些 buffer 里含有 Mg 离子,自己换算一下,让最后的 Mg 离子浓度能在 1.5左右。

5)不含 Mg 的 buffer 要单加 Mg。

6)上下游引物 ,一般自己把引物公司合成的引物稀释成 10pmol/ul,1-2ul 即可,因为标准的 PCR 体系需要 10-100pmol 。

7)余下成分用水补平。

本人觉得影响 pcr 最大的因素是: Mg 浓度,退火温度 ,循环数 ,其中 Mg 浓度为重中之重,有时候甚至有点苛刻, 浓度过高抑制 taq 酶,过低 taq 酶没用,就像那个谁形容的美女,多一分则太肥,少一分又太瘦 。所以建议做个梯度 ,找到最适浓度。 退火温度嘛,应该好摸,一般的实验室都有梯度 PCR 仪的,至于循环数 ,30-40 个,试情况自己定。 这些东西关键是自己摸,多摸几个,不用十八摸那么夸张,七八摸应该就可以出来了。

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