做免疫荧光经验求分享？

如果核定位不好,建议封闭和打孔合为一步,即在封闭液中添加0.5% TRITON-100,37度封闭2小时,加一抗后最好4度孵育过夜(16小时)。

实验步骤

1. 在22x22 mm 的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%~70%汇合。

2. 在-20℃用100%甲醇固定细胞3分钟。

3. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。

4. 在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。

5. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。

6. 在湿盒里与稀释为4 ug/ml 的荧光标记二抗室温温育1小时。

7. 用PBS洗四次，每次10分钟。

8. 用封片剂将盖玻片封在载波片上，用干净的指甲油将盖玻片封边，防止盖玻片滑动。

注意事项

1. 要在盖玻片一边角落做记号，以知道细胞在盖玻片的那一面。

2. 一抗的浓度需要经过实验摸索确定。

3. 第四步中如果用22×22 mm 盖玻片，则在盖玻片上加30 ul 稀释的抗体，并且将盖玻片倒置在玻璃载玻片上，然后将载玻片放到湿盒里，在室温温育。

1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30 min。

4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃ 、室温、37℃ ，其中 4℃ 效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 过宿和从冰箱拿出后 37℃ 复温 45 min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件：二抗一般室温或 37℃ 立即观察，若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用 DAPI 复染。

7、封片：为了长期保存，一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是 3 miundefined3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次5_min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。PBS 的 pH 和离子强度的使用和要求。建议 pH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01 M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

核蛋白免疫荧光是一种常用的细胞学和分子生物学实验技术，用于检测核内蛋白质的表达和定位。下面是一些注意事项和技巧，可帮助您在实验中获得更好的结果：

细胞固定：使用适当的细胞固定剂和条件固定细胞，以确保蛋白质的保留和细胞形态的完整性。常用的细胞固定剂有4% paraformaldehyde (PFA) 和methanol。

渗透化：细胞膜是有机膜，通常会对一些分子和化合物进行阻挡。为了使抗体能够渗透到细胞内并与目标蛋白质结合，必须进行细胞渗透化。 常用的渗透剂包括0.1-0.5%的Triton X-100和0.2-0.5%的Tween 20。

抗体：确保使用高质量、特异性良好的抗体，而且应按照建议的稀释倍数进行稀释，过高或过低的稀释倍数可能导致免疫荧光染色效果不理想。建议进行对照实验，例如使用无定位的抗体或者在细胞中过度表达目标蛋白等。

染色：为了避免非特异性的荧光背景，应在样本中加入适当的负对照和阳性对照。另外，染色时间也应该控制在适当的范围内，过短的时间可能导致染色弱，过长的时间可能导致背景过多。

显微镜观察：免疫荧光染色后，应使用合适的显微镜观察。常用的显微镜包括荧光显微镜和共聚焦显微镜。同时，也需要控制成像参数，如曝光时间和灵敏度，以获得最佳的成像效果。