求经验分享

密度梯度离心其实照着试剂盒操作即可，也不复杂；以下是配制和使用方法：

Percoll的原液（未稀释）必须先加入高盐溶液或者高浓度蔗糖溶液，目的是维持最终所得密度介质的生理盐浓度。最快捷简单的方法：一步法直接稀释Percoll。无菌条件下，在离心管中加入1/10总体积的1.5M NaCl或者2.5M的蔗糖溶液（例如制备100mL工作液，则需要加入10mL的高渗溶液，分离细胞时选择NaCl较多，而分离亚细胞结构时选择密度更高的蔗糖溶液），然后计算所需Percoll原液体积，并最终用灭菌水补加到最终体积。配置公式如下：

我用percoll提过肝原代细胞，原理其实差不多，根据不同细胞的密度不同进行分离

1、 颈椎脱臼法处死小鼠(C57型小鼠)，放在75%酒精中侵泡3-5分钟后，拎出后将小鼠铺于超净台上一个消毒托盘上。

2、 无菌提取小鼠的四肢骨，用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。酒精浸泡

3、 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs（大腿骨）and Tibias（胫骨）,剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。用纱布将骨头上的肌肉用纱布擦拭（特别注意了未将骨腔露出），酒精浸泡

4、 骨头是在去除肌肉后浸入RPMI 1640培养基中

5、 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗骨髓，每次1ml,胫骨冲洗两次，股骨冲洗三次，200g离心3分钟并重悬于2ml55%percoll中，从底部缓慢加入2ml65%percoll,然后再从底部缓慢加入3ml78%percoll,随后在2000rpm下离心20分钟,10摄氏度，升6降2.

6、 成熟的NEs是在65和78％级分的界面处回收，并用冰冷PBS洗涤三次

这是我的protocol

已经用裂红处理，但是仍然没有很大改善，纯度只有50%左右