提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

分享自己关于qPCR(RT-PCR)数据相对定量的分析方法与经验

&丁香园

99824

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验,也看了很多的资料,包括Nature protocol, AB官方的分析教程,MIQE,甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。

我在这里跟大家分享一下自己的经验,最常用,最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法,该法最最简单的说就是:

首先将一次实验的所有基因Ct值整理好,之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct;换成公式就是:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);

然后,将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好,整理进Excel,用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct,并同时对所有结果取相反数(就是加一个负运算,正数就变成负数,负数就变成正数),该步运算得到的结果就是-△△Ct。

最后,对-△△Ct进行2的幂运算,即2^-△△Ct就得出Fold Change。

但是,我想说的是2^-△△Ct得出的是Fold Change,不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因mRNA的情况,同时还具有放大效应,所谓放大就是本来A基因的-△△Ct得到为2,B基因-△△Ct为4,两者相差2,经过2的幂运算之后,A基因为4,B基因为16,两者相差12!

• 相对定量本身就存在放大的情况,若是再采取2^-△△Ct就只能说看看趋势而已了,所以我在这里给大家推荐ABi官方的一个分析方法,就是log2R,就是log2为底对R求对数。当相对定量分析时,默认扩增效率E趋近或等于100%,这时候R就是2^-△△Ct,当然原本的R的公式我会在后面附上,感兴趣的朋友可以自己去推导。

所以,我用的方法就是只计算到-△△Ct这一步就够了,这样得到的数据就有了正值与负值,正值表示较对照组mRNA上调,负值表示较对照组mRNA下调,作出图来非常直观,一目了然,也没有放大效应,显著性分析较为靠谱。这种运算方法最关键的在于负号以及实验组和对照组要分清楚!要不就得到相反的结果。

附上R的完整公式: R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)

其中,E1:目的基因引物扩增效率;E2:内参基因引物扩增效率;△Ct1:实验组目的基因Ct值差;△Ct2:对照组目的基因Ct值差。 你观察这个公式时候就发现,当扩增效率E为1(即100%)时,该公式就等于2^-△△Ct,这就是为什么会有2^-△△Ct方法的原因!!! ABi官网里的一款商业软件能直接给出每次试验每对引物的扩增效率E,能得到较为实际的R值,所以ABi的商业软件会对R进行log2的运算,进而得到直观的结果

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序