几个有关primer5.0引物设计的问题，急请各位帮忙!!!
丁香园论坛
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本人刚进实验室，目前在做实验前的准备工作，在引物设计遇到一些困难，希望各位战友能帮帮忙！
我的序列如下，为双链RNA病毒，准备做克隆表达。
1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat
61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga
121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt
181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtttggatat gatgctgtct gctgctggta
241 taaatgttgg accgatatcg ccagactata ctcaacatat ggctacgatt ggtgtactag
301 caacaccgga aatacctttt acaacggaag cggcgaatga aatagctcga gtgactgggg
361 agacttcgac atgggggcca gcgcgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaga
421 ccttccaacc agggaggtgg ttcatgcgcg ccgctcaagc agtaactgca gtagtgtgcg
481 gtccggatat gattcaagtg tcacttaatg ctggagcgag aggagatgta caacagatat
541 ttcagggtcg taatgatccc atgatgatat atttagtgtg gaggagaatc gaaaactttg
601 cgatggcgca aggtaattca cagcaaactc aagcgggtgt gactgtcagt gttggtggag
661 ttgacatgag ggcgggacgc attatagcgt gggatggaca ggccgcgctg catgtgcata
721 atccgacaca acagaatgcg atggtgcaaa tacaggttgt gttctatata tctatggata
781 aaactttaaa ccagtacccc gctttgactg ctgagatttt caatgtttac agcttcaggg
841 accacacatg gcatgggcta agaacggcga tattaaacag aaccacactg ccaaacatgc
901 tgccaccaat cttcccacca aatgatcgag atagcatctt aactcttcta cttttatcta
961 cacttgctga tgtttacact gttttaaggc cagagtttgc gattcacggc gtaaatccga
1021 tgccagggcc gctcacacgt gctattgcgc gcgccgccta tgtgtagtcc actttgcacg
1081 ggtgtgggtt acatatgcgg tgtgtcggtt gtgggaaata tgtaacccat ttaaacgtct
1141 cttagattac acttac
我用primer5。0，可是对于这个软件的具体公用还是不太了解。首先想请问，1 我的序列是从NCBI上找的，要做RT-PCR是不是用这个软件操作就会不同，我现在就是分别点s/a反义正义分开设计，这样可以吗？2 设计引物时，我先点Primer,再点撒s或a,然后是Edit Primers我要在两端分别加酶切位点，可是加了之后原先的引物就往后移动，且不一一对应了。3 因为要做表达，所以引物1要包含ATG引物2要包含TAG，可是在这个范围内移动，总会下面显示红色的Found，这时我是否可以修改其中的碱基，有什么要求可以不影响引物的作用呢？4 为什么我设计正义引物时，下面的Dimer显示红色Found这个应该是二聚体的意思，是指和反义引物形成二聚体吗？那为什么根本都没设计反义的它也会出现，是否可以不用理会？5 想知道Falsa Priming是什么意思，假如出现红色Found应该做何修改！6我也试着在网上一些免费设计引物的地方寻求帮忙，但是上面总显示我设定条件太苛刻，例如我在一些资料上看到G+C含量一般在45％－50％Tm在58－70度，退火温度一般在55度，这些是这样吗？如果还能放宽松，应该是什么限度？
我的序列如下，为双链RNA病毒，准备做克隆表达。
1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat
61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga
121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt
181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtttggatat gatgctgtct gctgctggta
241 taaatgttgg accgatatcg ccagactata ctcaacatat ggctacgatt ggtgtactag
301 caacaccgga aatacctttt acaacggaag cggcgaatga aatagctcga gtgactgggg
361 agacttcgac atgggggcca gcgcgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaga
421 ccttccaacc agggaggtgg ttcatgcgcg ccgctcaagc agtaactgca gtagtgtgcg
481 gtccggatat gattcaagtg tcacttaatg ctggagcgag aggagatgta caacagatat
541 ttcagggtcg taatgatccc atgatgatat atttagtgtg gaggagaatc gaaaactttg
601 cgatggcgca aggtaattca cagcaaactc aagcgggtgt gactgtcagt gttggtggag
661 ttgacatgag ggcgggacgc attatagcgt gggatggaca ggccgcgctg catgtgcata
721 atccgacaca acagaatgcg atggtgcaaa tacaggttgt gttctatata tctatggata
781 aaactttaaa ccagtacccc gctttgactg ctgagatttt caatgtttac agcttcaggg
841 accacacatg gcatgggcta agaacggcga tattaaacag aaccacactg ccaaacatgc
901 tgccaccaat cttcccacca aatgatcgag atagcatctt aactcttcta cttttatcta
961 cacttgctga tgtttacact gttttaaggc cagagtttgc gattcacggc gtaaatccga
1021 tgccagggcc gctcacacgt gctattgcgc gcgccgccta tgtgtagtcc actttgcacg
1081 ggtgtgggtt acatatgcgg tgtgtcggtt gtgggaaata tgtaacccat ttaaacgtct
1141 cttagattac acttac
我用primer5。0，可是对于这个软件的具体公用还是不太了解。首先想请问，1 我的序列是从NCBI上找的，要做RT-PCR是不是用这个软件操作就会不同，我现在就是分别点s/a反义正义分开设计，这样可以吗？2 设计引物时，我先点Primer,再点撒s或a,然后是Edit Primers我要在两端分别加酶切位点，可是加了之后原先的引物就往后移动，且不一一对应了。3 因为要做表达，所以引物1要包含ATG引物2要包含TAG，可是在这个范围内移动，总会下面显示红色的Found，这时我是否可以修改其中的碱基，有什么要求可以不影响引物的作用呢？4 为什么我设计正义引物时，下面的Dimer显示红色Found这个应该是二聚体的意思，是指和反义引物形成二聚体吗？那为什么根本都没设计反义的它也会出现，是否可以不用理会？5 想知道Falsa Priming是什么意思，假如出现红色Found应该做何修改！6我也试着在网上一些免费设计引物的地方寻求帮忙，但是上面总显示我设定条件太苛刻，例如我在一些资料上看到G+C含量一般在45％－50％Tm在58－70度，退火温度一般在55度，这些是这样吗？如果还能放宽松，应该是什么限度？
