🔥 多重 PCR

传统的多重 PCR（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）是在普通 PCR 的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。因在同一体系里加入多对引物合成多对扩增子，易发生引物间及扩增子间的串扰，故需要对体系进行优化，否则会造成检测结果的不准确。

随着科学技术的发展，MPCR 技术在扩增和检测方面已经取得了许多新的突破。在扩增方面，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分散于相对独立的空间中进行扩增；在检测方面，不断有新的超多重检测技术的出现，更有多重 RT-PCR 被广泛应用于多种基因的同时定量定性。

多重 PCR 常被用于：病原体识别、高通量 SNP 基因分型、突变分析、模板定量、连锁分析、RNA 检测、法医研究。同时也能够比对多个扩增子，联合应用 RT-PCR 技术还可达到定量的目的。

器材：PCR 热循环仪、电泳仪、凝胶成像设备、离心机等。

试剂：

① 高压过的超纯水（高压的目的是使其中的 DNase 失活，以免降解模板 DNA）；

② PCR 缓冲液（选用与所用聚合酶对应的缓冲液）；

③ 4 种 dNTP 混合物（每种 dNTP 的浓度为 2.5 mmol/L）;

④ Taq DNA 聚合酶（不同厂家、不同批次的酶可能会有差异）；

⑤ 引物（引物合成后，用超纯水稀释为 10 mmol/L）；

⑥ DNA 模板（尽量使用纯化后的核酸作为模板）。

注：②~④ 尽量选择商品化的多重 PCR 反应混合液，即 Multiplex PCR MasterMix，以确保反应体系的稳定性和实验的可重复性。

多重 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）选择目标基因

由于多重 PCR 在同一个反应体系中需要加入多对引物。同时，扩增区域的选择必须符合分析的目的，如通常对于致病微生物，需要选择其保守序列，如 16SRNA，或者毒力基因、毒力相关基因，以防止检测到非致病突变体而无法解释结果；对于需要分型的对象来说，需要选择它们之间有差异的保守序列进行扩增；对于高度同源的序列来说，可以用相同的引物进行扩增，但获得的阳性结果需要利用特异探针杂交或限制性酶切进行进一步确定；缺失分析选择扩增外显子；法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志；转基因检测则选择转入的动植物基因座；性别鉴定一般选择 X 或 Y 性染色体上特有的基因座。对于含有多个外显子的基因缺失分析来说，可选择缺失热点较广区域或缺失密集区域。相邻近的外显子可用跨越这两个外显子的引物进行扩增。

（二）引物设计

多重 PCR 的引物设计除了要满足一般 PCR 引物设计的原则外，还要需遵循以下标准：

① 多重 PCR 检测需要设计大量引物，因此要求设计的引物长度合适，通常采用长度较短的引物，引物碱基长度为 18~22 bp；

② 各引物之间不能互补，尤其避免 3' 的互补，以免形成二聚体；

③ 保证各引物的特异性，应避免与其它扩增片段和模板互补，扩增片段之间也不能有较大的同源性；

④ 使用 Tm 相似的引物，最好在 55 °C~60 °C 之间；对于 GC 含量较高的序列，建议采用 Tm 较高的引物（最好为 75 °C~80 °C），允许在同一体系中使用的引物 Tm 变化在 3~5 °C 之间；

⑤ 各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别，以便于用电泳的方法进行区分。一般来说，产物片段越大，其长度的差别也应该越大；同时也应减少小片段扩增产物的比例，小片段产物更易扩增，容易在混合体系中占据扩增优势。在设计引物时除对每个引物进行 blast 和单独评价之外，还可利用在线多重引物设计工具进行评价和优化，如 ThermoFisher 的 Multiple Primer Analyzer。

（三）核酸提取

核酸依赖的检测方法受目标核酸纯化的影响，核酸的纯化程度决定了核酸方法的应用。在条件允许的情况下，多重 PCR 需要以纯化的 DNA 为模板，可以确保多重 PCR 的顺利进行。

（四）体系优化

① 模板优化：模板浓度的确定，对于不同来源的模板需在纯化后确定最适浓度；

② 引物的单独 PCR 验证：在进行多重 PCR 之前，必须先对每对引物进行单独 PCR，同时设置引物浓度梯度和 Taq 酶浓度，确定每对引物的特异性和最佳反应浓度，然后依次增加引物对进行 PCR 进行优化；

③ 循环参数的优化：循环条件中退火温度及时间以及循环数对检测结果影响较大，通过尝试设置温度和时间梯度以及不同的循环数扩增定量的模板，反应完成后比较扩增结果，确保在相同的循环条件下所有的引物都能扩增出对应的特异性产物条带，以确定最终多重 PCR 中的循环参数。

（五）多重 PCR 扩增

按以下体系配制多重 PCR 反应体系（以 20 uL 反应体系为例，应与优化时体系各组分浓度一致）：

2×Multiplex PCR MasterMix  5 μL，各个引物混合共 n uL（依据上一步优化的浓度加入，并不一定需要各引物等浓度混合），DNA 模板 m uL（依据上一步优化的浓度）1 μL，加灭菌水补至 20 uL。

多重 PCR 扩增程序（其中退火温度时间以及循环参数按上一步优化的具体参数设定，以下程序以退火温度为 55 °C，退火时间 45 s，总循环数为 37 为例）：

采用 Touch-down 扩增程序 ，94 °C 变性 5 min；94 °C 变性 30 s，65~56 °C 退火 45 s，72 °C 延伸 1 min，10 个循环，每个循环退火温度降低 1 °C；94 °C 变性 30 s，55 °C 退火 45 s，72 °C 延伸 1 min，27 个循环；72 °C 延伸 7 min。4 °C 保存。

（六）结果检测

多重 PCR 结果可直接使用琼脂糖凝胶电泳、PAGE 凝胶电泳或者毛细管电泳分析。

1. 反应体系的优化

（1）引物浓度：先对不同的引物进行单个 PCR 扩增，确定单个 PCR 各引物的最佳浓度，然后按照多重 PCR 的实验流程，进行两个或多个引物对的多重 PCR 预实验。即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。多重 PCR 反应中各引物的浓度差异一般都凭经验获得。只有在调整引物浓度达不到要求时才考虑调整别的反应条件，例如改变反应体系中 Mg²⁺ 或 KCl 的浓度等。理论上讲，引物和基因靶序列的摩尔比至少为 108:1 如此过量的引物才能确保模板 DNA 一旦变性就与引物退火，而不是与其自身退火。一般引物量至少要 10 倍于模板量。

（2）模板及模板浓度：从血和新鲜组织中提取的 DNA，浓度和质量均能满足多重 PCR 的要求。对于从菌体提取的 DNA，为了减少样品对扩增结果的影响，裂解液中加入的菌量不能太多，否则会因裂解不完全，菌体蛋白抑制 DNA 聚合酶的活性，造成假阴性结果。
几种不同来源的模板 DNA 的浓度为：哺乳动物基因组 DNA 100 μg/mL；酵母基因组 DNA 1 μg/mL；细菌基因组 DNA 0.1 μg/mL；质粒 DNA 1~5 ng/mL。

（3）dNTP 和 MgCl₂ 的浓度：PCR 反应中一般用的 dNTP 和 MgCl₂ 的浓度分别为 200 μmol/L 和 1.5 mmoI/L。Mg²⁺ 浓度在很大程度上影响扩增的特异性，Mg²⁺ 一般正比于 dNTP 的浓度，这个比值确定好后可以在调整其它反应条件时保持恒定。另外，dNTP 母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融 3~5 次后，多重 PCR 反应常常不能很好进行，扩增产物几乎完全不可见，但 dNTP 的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。

（4）PCR 缓冲液（KCl）的浓度：如果多重 PCR 系统性地对扩增长的 PCR 产物有倾向性，最佳的选择是设计一系列多重 PCR 实验，固定 Mg²⁺ 浓度 (1.5 mmol/L)，依次递增 KCI 的浓度（1~2 倍），对每对引物进行再优化。相反，如果倾向于优先扩增较短的产物，则应在保持 KCl 浓度不变的情况下逐步提高 Mg²⁺ 浓度 (直至 4.5 mol/L)。如果所有产物的扩增效率都很低，试着提高模板和 Taq DNA 聚合酶的浓度。PCR 缓冲液的浓度从 1x 提高到 2x 可以明显提高多重 PCR 的效率。

（5）Taq DNA 聚合酶：随着多重 PCR 体系中引物对数目的增多，dNTP 和聚合酶的量也要相应增加。不同厂家的酶质量也有差异，需要做浓度梯度实验，寻找最佳的用酶量。使用过多的 Taq DNA 聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高，反应的特异性降低。可以在 25 μl 反应体积中加入 2 U，然后根据扩增结果进行轻微的调整。

（6）辅助剂（如 DMSO、甘油、BSA）的应用：在多重 PCR 反应体系中加入 50~100 mL/L 的 DMSO 或甘油能够提高多重扩增效率和敏感性，得到更多的扩增产物和减少非特异扩增。但是这些辅助剂可能会在另一方面干扰实验效果，因为它对各基因位点扩增效率的影响不同。 50 mL/L 的 DMSO 可能会提高某一位点的扩增效率，降低另一位点扩增产物的数量，而对某些位点则根本不产生影响；同理，DMSO 可能抑制也可能是促进非特异性扩增。因而使用这些辅助剂的效果需要在每个具体的反应体系中加以验证。加入适量的 BSA（如 1.0 g/L）能显著提高多重 PCR 扩增效率。有时候 BSA 效果要比 DMSO 和甘油好，但它的作用同样也需要实验的验证。

2、反应条件的优化

由于在一个多重 PCR 反应体系中有多对引物，而且扩增的模板片段长度也不尽相同，所以各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重 PCR 反应总是遵循较小片段优先扩增的原则，各对引物所要求最佳 PCR 条件也不尽相同（设计多对引物进行多重 PCR 时，应使各引物所需 PCR 扩增条件尽可能一致），因此在选择多重 PCR 扩增条件（尤其是退火温度和时间）时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件。

（1）退火时间和温度：在循环参数中，影响多重 PCR 扩增效率的主要因素是复性温度和延伸时间。复性温度的设置策略与单个 PCR 相似。先计算引物的熔解温度（Tm），在此基础上推算复性温度 Ta（Ta = Tm - 5）。可以用「逐步引入法」确定多重 PCR 的最佳 Ta，即每增加一对引物，就根据扩增的结果调整复性温度，直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加，延伸时间也应延长。在最佳的 Mg²⁺ 和 dNTP 浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量，比单纯增加 Mg²⁺ 和 dNTP 浓度更为有效。退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响，将退火温度降低 4~6 ℃ 对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增的影响，同样，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。

（2）延伸温度：高的延伸温度会减少某些基因的扩增，即使用长的退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。

（3）延伸时间：在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重 PCR 中增加延伸时间，可以增加较长 PCR 产物的量。也有实验表明，当延伸时间延长时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。

（4）PCR 循环数：PCR 产物量增加最明显的是在 25 个循环附近。通常对于一个反应 20~30 个循环就足够了，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。总之，多重 PCR 反应条件的设置是一个棘手的问题，也是多重 PCR 成功的保证。一般策略是首先进行单个 PCR 反应，分别设定各引物对应的条件；然后，依次增加引物对，不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。

针对多重 PCR 中的常见问题，可以通过改变影响 PCR 扩增效果的因素来解决。

1. 若所有产物条带都很弱

①增加延伸时间；

②降低延伸温度至 62~68 度；

③逐步降低退火温度；

④调整 Tag DNA 聚合酶的浓度；

⑤同时应用以上 4 种策略。

2. 若短片段产物条带较弱

① 缓冲液浓度从 1 X 增加至 1.5 X 或 2 X；

② 降低退火或延伸温度；

③ 增加弱条带相对应的引物量；

④ 同时应用以上 3 种策略。

3. 若长片段产物条带较弱

① 增加延伸时间；

② 增加退火和/或延伸温度；

③ 增加弱条带相对应的引物浓度；

④ 降低缓冲液浓度至 0.7 X~0.8 X, 同时保持 MgCl₂ 浓度 1.5~2 mmol/L 不变；

⑤ 同时应用以上 4 种策略。

4. 若出现非特异产物

① 若非特异产物是长片段，增加缓冲液浓度至 1.4 X~2.0 X；

② 若是短片段，降低缓冲液浓度至 0.7 X~0.9 X;

③ 逐渐增加退火温度；

④ 减少模板和聚合酶的用量；

⑤ 增加 Mg²⁺ 至 3 mmol/L，6 mmcd/L、9 mmol/L，12 mmol/L，同时保持 dNTP 浓度恒定在 200 ptmol/L；

⑥ 同时应用以上 5 种策略。

5. 若以上方法都未见效，可以进行以下尝试

① 加入辅助剂 BSA（0.1~0.8 pg/p）;

② 加入辅助剂 DMSO 或甘油（5%，体积分数）；

③ 重新比对引物，确保引物之间不存在相互作用；

④ 更换所有溶液，用新的 dNTP。