细胞培养技术——清洗、消毒

细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。

细胞培养的基本设备与用品

（1）细胞培养的基本设备

细胞培养的基本设备有：CO₂ 培养箱、倒置显微镜、净化台、压力蒸汽消毒器、自动双重纯水蒸馏器、液氮罐、冰箱、电热干燥箱、电热恒温培养箱、电动吸引器、抽气泵等。

（2）常用的实验用品

1. 玻璃器皿

细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：

• 国产螺旋口培养瓶有 12.5 毫升、25 毫升、100 毫升等规格，国外培养瓶常以底面积（平方厘米）表示；
• 培养皿（直径有 3.5 厘米、6 厘米、9 厘米、10 厘米等规格）；
• 离心管（5 毫升、10 毫升)；
• 注射器（1 毫升、5 毫升等）；
• 用生理盐水瓶代替的贮存瓶（100 毫升、250 毫升、500 毫升）；
• 青霉素瓶（5 毫升）；
• 西力辛瓶（10 毫升）；
• 其它还有尖吸管和移液管、载玻片（厚度 0.8～1.2 毫米）、盖玻片（厚度 0.12 毫米）、贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒、漏斗、烧杯、量筒、贮蒸馏水瓶、冷冻管（1.5毫升、2毫升）等。

2. 塑料品

多孔培养板规格有 4、6、12、24、96 孔等，培养皿直径有 3 厘米、6 厘米、10 厘米等。

塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用的需经特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细胞易于生长。

3. 器械

解剖刀、眼科剪和镊(直头和弯头)、中号圆头镊、止血钳等。

4. 杂用品

金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、搪瓷盘、吸头(吸取液体的胶帽)、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。

组织培养中使用最多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。实验者手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能保证实验中的循环使用。

1.1 常用玻璃器皿清洗

1.1.1 清洗要领

• 浸泡

初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铝和砷等。

空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。使用前，新器皿浸泡在 5％ 稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑；然后经简单刷洗，流水冲洗（逐片进行），蒸馏水浸泡，干燥备用。

新玻片处理后，短时间不用时，需将它投入 95％ 的酒精中保存，以防玻片长霉。

培养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿中残留的细胞、蛋白质一旦干涸，即固着于玻璃表面，极难脱落。

• 刷洗

用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水中煮沸，然后将适量洗涤剂（洗洁精或洗衣粉）投入沸水中继续煮沸 10 分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗后浸入清水中进行冲洗。

• 酸泡

刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡 24 小时，清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的极微量杂质。

1.1.2 清洗步骤

玻璃器材煮沸 10 分钟 → 刷洗 → 流水振荡冲洗 15-20 遍 → 50℃ 烤干 → 清洁液浸泡 24 小时 → 流水振荡后冲洗 15-20 遍 → 漓水 → 蒸馏水浸泡 2 次（每次 24 小时）→ 50℃ 烤干，待包装。

1.1.3 清洗注意事项和要求

① 使用后的实验器材应立即投入清水中。

② 浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。

③ 刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗，不得残留洗涤剂、清洁液。

方法是：每瓶灌 2/3 容积的自来水，振荡后倒掉，重复 15~20 次（尖滴管置量杯中冲洗）。

④ 煮沸前的水面要高于器材 5 厘米，水沸后投入洗涤剂（直径 35 厘米的铝锅，用洗衣粉 10 克左右）。若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂，均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化，pH 值上升。

⑤ 软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂，会改变培养液 pH 值和毒害细胞。

⑥ 清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。

⑦ 使用后的胶塞与玻璃器材同时煮洗时，胶塞要放在煮锅的底部。

⑧ 浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如「蒸馏水Ⅰ 盆」、「蒸馏水Ⅱ 盆」。

⑨ 器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，省时又保证清洗质量。

⑩ 用超声波仪清洗器材时，清洗要求同上。

1.2 橡胶制品的清洗

新购置的橡胶制品（胶塞、胶管、橡皮乳头）的洗涤方法如下：

0.5 摩尔/升 NaOH 煮沸 15 分钟→流水冲洗→0.5 摩尔/升 HCl 煮沸 15 分钟→流水冲洗→自来水煮沸 2 次→蒸馏水煮沸 20 分钟→50℃ 烤干备用。

这样处理可完全除净胶塞上的硫磺等有毒物质。用过的胶塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，故胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷逐个刷洗。在使用过程中，胶塞不能与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。

1.3 G6 除菌滤器的清洗

新 G6 除菌滤器置玻璃洗液中浸泡 24 小时，流水缓慢冲洗，至 pH 值为 5.5 左右，然后用 4 倍的蒸馏水缓慢冲洗，再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。用过的 G6 除菌漏斗立即浸泡水中（注意：滤器千万不能干涸）过夜，流水缓慢冲洗 24 小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50℃ 烤干，滤器再置清洁液中浸泡 24 小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新 G6 除菌滤器。

1.4 正压除菌滤器的清洗

新的或使用后的正压滤器经稀洗涤剂刷洗一流水冲洗 15 分钟→漓水→去离子水浸泡 24 小时→三蒸水浸泡 24 小时→干燥备用。

1.5 塑料制品的清洗

塑料制品质地软且耐腐蚀能力强，但不耐热，易出现划痕。

其清洗程序为：器皿用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布、棉签和 50℃ 稀洗液刷洗→流水冲洗：人工冲洗 15~20 遍→晾干→浸于清洁液中 15 分钟→流水冲洗→蒸馏水浸泡两次（每次 24 小时）→晾干备用。

1.6 清洗液的配制

清洁液

新配制的清洁液为棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效。

先在搪瓷盆中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，再将盆置流 动自来水中，待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。

玻璃滤器洗液

取 10 克硝酸钠和 28.6 毫升浓硫酸，放入盛有 470 毫升蒸馏水的玻璃缸内混匀备用。