贴壁细胞培养

在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖的离体动物的培养细胞。

由于血清具有终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其它营养成分及细胞因子，因此成为体外细胞培养液中的常用添加成分，其对细胞的培养意义重大。

【材料与试剂】

细胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培养基（以 DMEM 为例）、100X 双抗（链霉素-青霉素）、胎牛血清、细胞冻存液。

【实验仪器与耗材】

培养皿或培养瓶、移液枪、离心管、记号笔、封口膜、冻存管、程序降温冻存盒、液氮罐、离心机、37℃ 恒温培养箱（5% 二氧化碳浓度）、倒置相差显微镜、冰箱、无菌细胞操作台。

1. 将含有冻存细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。

2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒，打开安瓿，用吸管将细胞转移到含有 5 ml 起始培养基的 25 cm² 组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入 5% CO₂ 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。

3. 吸出起始培养基，换成适当的维持培养基。将细胞放回 CO₂ 培养箱 37℃ 培养，每天检查细胞是否生长至汇片。

4. 如果细胞生长至汇片，吸出培养基。

5. 用 PBS 或胰酶/EDTA 清洗细胞，除去细胞上残留的血清，将洗液吸出。

6. 用 37℃ 、适当体积的胰酶/EDTA 刚好覆盖单层细胞（如对于 25 cm² 培养瓶需要 0.3 ml）。消化 30～40 s（细胞应该分开），晃动培养瓶使细胞完全分开。

7. 加入 1.4 ml 适当的维持培养基，用吸管来回吹打细胞悬液多次以打散细胞团（这些细胞用于传代）。

8. 吸出 0.5 mL 的细胞悬液，将其加入到新的含有 30 ml 维持培养基的组织培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入 CO₂ 培养箱中 37℃ 培养直到细胞生长至汇片（大约 1 周）。大约间隔一周用维持培养基进行 1 : 20 稀释传代以维持细胞生长。