OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法

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MEM细胞培养基

无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。

贴壁细胞的脂质体转染

一、实验材料

1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)

2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen 公司)

3、6孔细胞培养 版

4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)

5、转染级质粒

二、实验步骤

invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!

1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~undefined105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)

3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)

4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

三、个人经验：

我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。

3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的 DMEM，前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。

4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训!

5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。

6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。

加转染试剂(Opti-MEM I),细胞就浮起或死亡问题分析?

各位前辈：我想把microRNA转到成纤维细胞内，用的是GIBCO(tm) Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X)和Lipofectamine™ 2000转的。现在的问题是一加转染试剂细胞就大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。有时细胞死亡稍微好点，是不是和细胞批次关系更密切，还是有其他原因。

我的实验操作 ：

1 10%血清DMEM接种细胞在24孔板，长至30~50%满底时进行转染。

2 lipofectamine2000 0.5ul稀释于25 ul Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) (GIBCO)静置5分钟

3 microRNA 10pM 稀释于25 ul Opti-MEM

4 混匀2和3，加Opti-MEM至500ul。室温静置30min。

5 用PBS(室温)轻轻冲洗培养空，镜下观察部分细胞略变圆(或有变圆倾向)，但没什么细胞浮起。吸去PBS，轻轻加入2和3的混合物。镜下观察，即刻细胞大量浮起，或细胞挛缩，有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞，死亡情况略有不同。

问题分析：

1.不是说明书上说什么你就做什么，你是有自主意识的。

2.你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能：a。你养的细胞有问题，或者有共生菌，改变培养条件就可能爆发;b。你的细胞对opti-MEM敏感。为什么一定要用opti?你没有自己的主见吗?

3.你的转染有问题。从你的描述来看，你并不是接种后24hr左右立即做转染，而是让它长到50%左右，也就是如果不到50%，你也许会长更久，对吗?——这是转染实验的大忌，超过24hr细胞对转染会不敏感，转染效率下降。

4. 你转染时选择的细胞丰度也没有太大的问题，但是这个也是具体问题具体对待。像HeLa是绝对要30%左右的，就是这样48hr后，细胞已经铺得密密麻麻;就不要想95%了，那样的细胞只能扔掉，一天换几次新鲜的培养基也跟不上培养基变黄的速度。需要参考的东西包括你细胞原本的生长速度，对lipo2K的敏感程度(被抑制和毒死的情况，我可以负责任的告诉你lipo2K非常毒，他们的lipo2K是稀释到33%的产品，他们100%的lipo2K CD是另卖的，其中原因之一就跟毒性有关，没有多少细胞能耐受)，总之要确保你的细胞在24hr长到合适的浓度做转染，转染40-48hr后铺满孔，或多或少一点点也可。

5. 由于lipo2K毒性很高，如果实在不合适，你应该考虑更换其他的转染试剂;此外，应该用你的平时养细胞的培养基做转染，不过记得去除抗生素，另外稀释lipo2K和质粒的培养基要去血清去抗生素的。

6.无血清细胞处于一种应激状态，本来就长不好，这时候你投毒，当然更差。lipo2K不是不计较培养基是否有血清吗，所以在“双无”培养基稀释lipo2K 和RNA，形成复合物后可以投到含血清的无抗生素的培养基中。实际上我们转染用的培养基，double血清含量(普通5%，转染用10%)。早期lipo 的说明书要求“双无”，3hr后添加double血清培养基。实际操作发现，也可以直接投入double血清培养基中。

7.无抗生素的原因是，细胞膜被穿孔，抗生素进入直接杀细胞。

经验推荐：OPTI-MEM与PBS和无血清的 DMEM培养基相比较，Life Tech 的GIBICO无血清培养基OPTI-MEM的转染效率比较高，不妨试下。

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