贴壁细胞如何进行传代？

贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶，其作用是切断细胞和容器之间，细胞与细胞之间的相互粘连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做「消化」，「消化」之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

材料准备：

1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃ 水浴锅内预热；
2、用 75% 酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；
3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；
4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

传代流程：

1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。
4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞较好好，消化温度是 37℃。
5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
6. 弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。
7. 将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以 1000 rpm/min 离心 5 min。
8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
9. 将细胞悬液吸出分装至 2 - 3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5×105 /ml。最后要做好标记。
11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 - 4 h 后开始贴附在瓶壁上。

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