类器官的传代和冻存

DMEM，冻存管，移液器，离心机

类器官传代

（1）轻轻吸去培养基，各孔加入 500μl 凝胶消化液（以 24 孔培养板为例）；

（2）使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端，并用该枪头尖端将步骤（1）中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打，吹打时避免产生气泡，将胶滴吹散，放入冰盒上消化 20 min；

Tips：

1. 建议尽可能将胶滴吹散，避免影响消化效率。
2. 使用移液器吹打时，应避免移液枪头尖端接触到皿底。

（3）消化好的细胞悬液收集到 15 ml 无菌离心管中，加入 10 ml 无菌 D-PBS 溶液，4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min，弃上清；

（4）向沉淀中加入类器官消化液，37℃ 静置消化，每隔 5min 取出，机械吹打 10~15 次后镜检，直至消化成细胞团；

（5）进行接种培养。依据类器官的密度和状态按照 1：2~1：6 的比例传代。

类器官冻存

（1）轻轻吸去培养基，各孔加入 500μl 凝胶消化液（以 24 孔培养板为例）；

（2）使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端，并用该枪头尖端将步骤（1）中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打，吹打时避免产生气泡，将胶滴吹散，放入冰盒上消化 20 min；

Tips：

1. 建议尽可能将胶滴吹散，避免影响消化效率。
2. 使用移液器吹打时，应避免移液枪头尖端接触到皿底。

(3) 消化好的细胞悬液收集到 15 ml 无菌离心管中，加入 10 ml 无菌D-PBS 溶液，4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min，弃上清；

(4) 加入 3ml 的 Advanced DMEM/F-12 重悬类器官，4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min；重复此步骤三次，彻底清洗类器官。根据类器官的数量加入合适体积的类器官冻存液；

※以类器官计数结果为 200 个类器官为例，加入 1ml 类器官冻存液，充分重悬类器官；

(5) 将类器官悬液转移至冻存管中，程序性降温至 -70℃ 以下后，转移至液氮中长期保存。