小鼠结肠类器官培养实战操作步骤

75% 乙醇，D-PBS，DMEM， Matrige，台盼蓝试剂，手术剪镊，生物显微镜，37℃ 恒温培养箱

1、取材

• 将小鼠断颈处死后，放在 75% 乙醇中浸泡 2 次， 转移至生物安全柜；
• 小鼠腹部向上摆放，用镊子轻轻夹起小鼠生殖口上 1cm 处皮毛，用剪刀以 V 形斜纵向剪开皮毛；
• 更换镊子和剪刀， 轻轻夹起腹膜以同样方式剪开腹膜。取近肛门端大约 10cm，去除盲肠部分，置于盛有冰 D-PBS 的 60mm 培养皿中，使用镊子去除肠道外部的膜、血管和脂肪。用注射器从结肠一端注入 D-PBS 反复冲洗，至内容物完全冲洗干净，放置于新的含预冷 D-PBS 的培养皿中；
• 使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用无菌玻璃片轻轻刮肠腔表面。待肠绒毛被刮净后，加入 D-PBS 反复清洗  3~5  次。

2、消化

• 将清洗后的结肠组织剪成 2mm 左右的小段，放置于预冷的 D-PBS 中（含有 5mM EDTA）中，4℃ 消化 30min，每隔 10min 轻轻摇晃一次；
• 用镊子夹出结肠片段，放到盛有预冷 Advanced DMEM/F-12 的培养皿中，使结肠片段完全浸没在 Advanced DMEM/F-12 中以终止消化；
• 加入3～5ml 预冷的 D-PBS，用移液枪上下吹打结肠碎片 10～20 次，取部分悬液放置于载玻片上进行观察，若隐窝数量较少可适当增加吹打次数。将所得到的隐窝悬液用 100µm 的滤膜过滤，收集隐窝滤液；
• 将隐窝滤液充分重悬后，取部分悬液进行台盼蓝染色观察活率并计数。提取的隐窝应为 U 型（如图 1 示例）；

图 1 小鼠结肠隐窝

• 将隐窝悬液与 Matrigel 在冰上混合（Matrigel 占比大于 70% 且混合液中隐窝密度为 8～20 个/μl，混合后的总体积约为 40μl），重悬时间不超过 30s 以避免 Matrigel 过早凝固；
• 将混合悬液接种在预热的 24 孔板底部正中央，每孔 30μl 左右，避免悬液接触孔板侧壁；
• 将接种完成后的培养板倒置置于37℃ 恒温培养箱中，孵育 15min 左右待 Matrigel 凝固；
• 待 Matrigel 完全凝固后，每孔加入 500μl 37℃ 预热的小鼠肠类器官完全培养基，确保 Matrigel 完全浸在培养基中；
• 将 24 孔板置于 37℃，5% CO₂  的恒温培养箱中培养并持续观察。理想情况下，隐窝应在 2～4h 内变圆，并且有清晰的边界（如图 2 示例）；

图 2 37℃ 培养 2h 后的隐窝大部分变圆

• 每 2-3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏 Matrigel；
• 密切监测类器官生长状态， 理想情况下， 小鼠结肠类器官应在 5～10 天内建成（如下图示例，显微镜下能够看到明显的出芽状态）。

图 3 成熟的小鼠结肠类器官