类器官培养与应用——肝类器官

肝脏是人体中最大的器官之一，是调节营养吸收和代谢的主要器官，能够中和摄入的有毒化合物，并产生体内近 50% 的循环蛋白质。肝脏由多种细胞类型组成，其中占比最高的是功能多样的肝细胞。

肝脏作为重要的“解毒”器官，在执行日常功能时会受到各种代谢、病毒的侵害，可能会导致不同程度的肝损伤。长期损伤形成的纤维化疤痕破坏了肝脏的完整性，并且还会诱导门静脉高血压等其它疾病。在大多数肝脏疾病和药物诱导的肝损伤(DILI)中，损伤始于肝细胞，同时也会激活其它类型细胞（如：KC 和 HSC）。因此，为了充分理解每种肝病的表型和损伤器官的机制，我们需要建立复杂的体外肝模型，以便于更好地进行肝脏相关的疾病和毒性研究。

本篇文章基于 Nature protocol^【1】和 Journal of hepatology^【2】发表的两篇文章，整理了人类诱导多能干细胞（human iPSCs）来源的肝脏类器官培养方案。

图 1. 人 iPSCs 来源的肝类器官培养方案^【2】

细胞来源

Human iPSCs

 

培养基配方

	MEFs培养基	iPSCs（I）培养基	iPSCs（II）培养基	DEs培养基	HEs培养基	HEs（II）培养基	HM培养基	EM培养基	DM培养基	近岸蛋白产品货号
基础培养基	DMEM-F12	RPMI-1640	RPMI-1640	RPMI-1640	RPMI-1640	HCM	DMEM-F12	DMEM-F12	DMEM-F12
penicillin-streptomycin	1%	1%	1%	1%	1%	1%	1%	1%	1%
dFBS（v/v）	10%	-	-	-	-	5%	-	-	-
KnockOut 血清替代物（KSR）	-	20%	20%	-	-	-	-	-	-
NEAA	-	1%	1%	-	-	-	-	-	-
GlutaMAX	-	1%	1%	-	-	-	1%	1%	1%
2-Mercaptoethanol	-	0.2%	0.2%	-	-	-	-	-	-
HEPES	-	-	-	-	-	-	10mM	10mM	10mM
N2	-	-	-	-	-	-	1×	1×	1×
N-Acetylcysteine	-	-	-	-	-	-	1mM	1mM	1mM
Leu15-Gastrin I human	-	-	-	-	-	-	10nM	10nM	10nM
hEGF	-	-	-	-	-	-	50ng/ml	50ng/ml	50ng/ml	C029
hHGF	-	-	-	-	-	10ng/ml	25ng/ml	25ng/ml	25ng/ml	CJ72
B-27	-	-	-	1%	1%	-	1×	1×	1×
A83-01	-	-	-	-	-	-	5μM	5μM	0.5μM
Nicotinamide	-	-	-	-	-	-	10mM	10mM	-
Forskolin	-	-	-	-	-	-	10μM	10μM	-
R-Spondin	-	-	-	-	-	-	-	1μg/ml	-	CX83
FGF basic	-	100ng/ml	5 ng/ml	-	10ng/ml	-	10ng/ml	-	-	C046
FGF-10	-	-	-	-	-	-	-	100ng/ml	-	CR11
FGF-19	-	-	-	-	-	-	-	-	100ng/ml	CG74
Oncostatin M	-	-	-	-	-	20ng/ml	10ng/ml	-	-	C099
ITS	-	-	-	-	-		5μg/ml	-	-
Dexamethasone	-	-	-	-	-	100nM	100nM	-	3μM
DAPT	-	-	-	-	-	-	-	-	10μM
BMP-4	-	-	-	-	20ng/ml	-	-	-	-
BMP-7	-	-	-	-	-	-	-	20ng/ml	25ng/ml
Activin A	-	-	-	100ng/ml	-	-	-	-	-	C687
ROCKi	-	-	10μM	-	-	-	-	-	-

 

iPSCs 培养和传代

1、将 100mm 培养皿包被 5ml 0.1%（w/v）的明胶，室温静置 15min 至明胶凝固。

2、在明胶上接种丝裂霉素处理过的 MEFs 细胞悬浮液，细胞数约为 1.8×10⁶ 个。放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养至细胞汇合度 70-80% 时进行传代。

3、吸去 MEFs 培养基，将 iPSCs 接种于明胶上，添加 10ml iPSCs（I）培养基，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养 3-5 天。

 

定向内胚层分化

4、在 60mm 培养皿中加入 2ml Matrigel，室温静置 2h 并添加 DMEM-F12 培养基至完全没过 Matrigel。

5、用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 冲洗 iPSCs 后，加入 300μl Accutase，37℃ 孵育 3-4min。

6、将消化下来的细胞悬液收集并 90g 离心 5min，收集细胞沉淀并加入 iPSCs（II）培养基，同时进行细胞计数。

7、将 iPSCs 接种在 Matrigel 平板上，接种密度为 1.5×10⁶ 个/60mm 平皿，接种后添加 4ml iPSCs（II）培养基，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中过夜培养。

8、接种后第二天，用 DEs 培养基进行换液，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养 6 天，每 2 天换液一次。

 

肝内胚层分化

9、用 HEs 培养基进行换液，放置在 37℃，5% 低氧的培养箱中培养 3 天。

10、用 HEs（II）培养基进行换液，放置在 37℃，5% 低氧的培养箱中培养 4 天，之后转移至常氧条件下培养 8 天，达到肝成熟。

 

类器官培养

11、肝成熟后的 9-12 天，在单层肝细胞上会出现三维结构，此时将漂浮的囊泡状细胞收集起来，加入 Matrigel 并放置在 37℃ 条件下 10min 使 Matrigel 凝固。

12、添加 HM 培养基并完全没过 Matrigel 顶部，每 3 天更换培养基，每 7 天机械传代一次类器官。

 

类器官扩增和分化

13、将 HM 培养基吸出，用 PBS 清洗后，加入 EM 培养基，放置在 37℃，5% 低氧的培养箱中培养 4 天进行类器官扩增。

14、随后用 DM 培养基进行换液，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养 6 天，完成进一步分化。

图 2. 扩增培养基（EM）和分化培养基（DM）孵育后的肝类器官免疫荧光图^【2】

 

肝类器官应用前景

类器官是一种能够进行体外更新和自组装的模型，相比于传统的二维(2D)细胞培养，类器官的生长环境更贴合生理条件。3D 培养的肝类器官可以用于疾病建模，以便确定疾病的机制以及治疗方法。研究表明，3D 培养的iPSC来源的肝类器官比 2D 干细胞更易感染乙型肝炎病毒^【3】。2019 年 Ouchi, R.et al.^【4】利用 iPSCs 来源的肝类器官，在体外模拟了炎症和纤维化，为进一步了解 Wolman 疾病打下了基础。

在药物毒性验证方面，肝类器官同样发挥着重要的作用。对乙酰氨基酚是药物引起肝衰竭的最常见来源，利用肝脏类器官可以实现药物的肝毒性验证，更适用于未来的药物筛选和开发^【5】。

 

参考文献

【1】TAKEBE, Takanori, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature protocols, 2014, 9.2: 396-409.

【2】MUN, Seon Ju, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of hepatology, 2019, 71.5: 970-985.

【3】Nie, Y. Z. et al.(2018). Recapitulation of hepatitis B virus–host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine, 35, 114-123.

【4】Ouchi, R. et al. (2019). Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell metabolism, 30(2), 374-384.

【5】Sgodda, M. et al. (2017). A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features. Stem cells and development, 26(20), 1490-1504.