肠类器官培养总是失败

同学你好，请问你现在培养有好转吗? 我遇到的问题和你类似，苦恼中…

肠类器官培养注意点

01肠道外部的膜、血管和脂肪，尽量去除干净，否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染；

02用注射器往肠腔内注入PBS，冲洗掉小肠内容物，可以减少后续洗涤时间；

03用无菌的载玻片刮去小肠内绒毛组织，尽量去除干净，可以减少杂细胞的产生，另外可以有助于小肠组织的消化，得到更多的小肠隐窝；

04小肠隐窝消化液用5 mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多会影响终浓度，有必要更换新的EDTA；

05因分离小肠隐窝需要时间较久，建议整个操作在低温进行，离心机调至4℃，PBS放冰上。试用移液器前用冷的PBS润洗移液器枪头；

06EDTA消化后，小肠组织会变松散，在外界机械力作用下，小肠隐窝会从组织中分离出来，可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分，可以挑选隐窝含量较高，杂细胞较少的分馏组分种板培养；

07得到分馏组分后进行隐窝计数，用完全培养基重悬隐窝至8~20个/uL，加入等体积基质胶混合，该过程一定要在冰上操作，混合过程切勿产生气泡，否则影响后续观察以及隐窝培养状态，混匀过程可以调小量程，吸取的液体不要全部吹出；

有以下几点建议：

1. 隐窝数量不多：你可以检查提取过程中是否有任何步骤可能导致隐窝的损失。确保在提取过程中注意保护和保存隐窝。另外，你可以尝试使用更高浓度的细胞悬液进行培养，以增加隐窝的数量。

2. 细菌污染：细菌污染可能来自于实验室环境、操作步骤、培养器具等。确保在实验过程中遵守无菌操作规范，并且彻底清洁培养器具和实验台面。另外，你可以尝试在培养基中添加更高浓度的抗生素来抑制细菌的生长。

3. 培养基操作问题：确认你在使用Stemcell商品化培养基时是否按照他们的说明书和视频进行操作。如果你遵循了正确的步骤，但仍然出现问题，可能需要与厂家联系，咨询他们的技术支持团队。他们可能能够提供更具体的建议，以解决你遇到的问题。

提取隐窝后，适当的提高密度，你的密度比较稀，然后可以用pbs冲洗后再加抗生素