小鼠胃类器官培养实战操作步骤

75% 乙醇，D-PBS，DMEM， Matrige，台盼蓝试剂，手术剪镊，生物显微镜，37℃ 恒温培养箱

1、取材

• 将小鼠断颈处死后，放在 75% 乙醇中浸泡 2 次，转移至生物安全柜；
• 小鼠腹部向上摆放，用镊子轻轻夹起小鼠生殖口上 1cm 处皮毛，用剪刀以 V 形斜纵向剪开皮毛；
• 更换镊子和剪刀，轻轻夹起腹膜以同样方式剪开腹膜，在小鼠左侧肝脏下找到小鼠呈荷包状的胃，将胃取出，减去不必要的筋膜部分；
• 用 D-PBS 将其涮洗 3 次，沿胃半径较大的弧侧用剪刀剪开，用预冷的 D-PBS 充分涮洗去除胃里面杂质后，将其在 60mm 培养皿中展开；
• 轻轻刮去表面浆膜肌（实际有肉眼观察不到浆膜肌的具体位置，所以在内外表面刮去表面少量组织），再用 D-PBS 涮洗一次。

2、消化

• 用剪刀将组织剪碎成 2～5mm² 的碎片，用 50ml 离心管收集起来。将离心机设置到 4℃；
• 加入 10ml D-PBS 剧烈吹打，静置 1min 待较大的碎片沉降后弃上清（大约需要 5 次至上清澄清）；
• 加入 10ml EDTA（10mM）室温消化 10min（每隔 2min，上下颠倒离心管使组织重悬起来）；
• 待组织沉降后去除消化液，将沉淀收集到一个干净的培养皿中，尽可能吸走消化液；
• 用透明光滑的玻璃片将腺体从组织中挤出（能够观察到白色组织被挤压到边缘）；
• 在显微镜下观察结构，能够观察到胃腺体从碎片中分离开来；
• 用 5ml Advanced DMEM/F-12 冲洗胃腺体，将其收集到 15ml 离心管中，4℃ 条件下 200g 离心 5min，弃上清；
• 用 1ml Advanced DMEM/F-12 将其重悬，取少量进行台盼蓝染色，显微镜下计算胃腺体活率，提取的胃腺结构如图 1 所示；

图 1 小鼠胃腺体形态

• 将胃腺体悬液与 Matrigel 在冰上混合（Matrigel 占比大于 70% 且混合液中胃腺体密度约为 8～20个/μl，混合后的总体积约为40μl），重悬时间不超过 30s 以避免 Matrigel 过早凝固；
• 将混合悬液接种在预热的 24 孔板底部正中央，每孔 30 左右，避免接触孔板侧壁；
• 将接种完成后的培养板倒置置于37℃ 恒温培养箱中，孵育 15min 左右待 Matrigel 凝固；
• 待 Matrigel 完全凝固后，每孔加入 500μl 预热的小鼠胃类器官完全培养基，确保 Matrigel 完全浸在培养基中；
• 将 24 孔板置于 37℃，5%  的恒温培养箱中培养并持续观察。理想情况下，腺体结构应在 2～4h 内变圆，并且有清晰的边界；
• 每 3 天更换一次培养基，更换培养基时避免破坏 Matrigel。培养 3～5 天后，胃类器官的形态如图 2所示。

图 2 小鼠胃类器官形态