类器官的鉴定

 基质胶，类器官培养基，移液器，CO₂ 培养箱

1.类器官收集

（1）轻轻吸去培养基，各孔加入 500μl 凝胶消化液（以 24 孔培养板为例）；

（2）使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端，并用该枪头尖端将步骤（1）中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打，吹打时避免产生气泡，将胶滴吹散，放入冰盒上消化 20 min；

Tips：

1. 建议尽可能将胶滴吹散，避免影响消化效率。
2. 使用移液器吹打时，应避免移液枪头尖端接触到皿底。

（3）固定：弃去上层培养基，向类器官沉淀中加入1ml 4% 多聚甲醛（PFA），充分混匀，置于冰上或者 4℃ 静置固定 1h；

（4）轻轻吸去固定液，向类器官沉淀中加入 D-PBS，使用枪头轻轻吹打混匀，静置 2～10min；小心吸去上清，重复步骤（4）清洗 2 次；

（5）待类器官自然沉降后弃去上清，仅保留类器官沉淀，用 70%乙醇悬浮，4℃ 保存（注意：类器官可在 4℃ 中保存数周）。

2.类器官包埋和切片

（1）类器官包埋固定：使用 50 μl 完全溶解的 3% 的琼脂糖溶液重悬类器官沉淀，并转移至 5ml 离心管中，冰上放置 30min，待其凝固。

注意：加热溶解琼脂糖时应避免琼脂糖溶液沸腾，否则会导致液体损失及浓度改变。

（2）取出已凝固的包含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%、95%乙醇各 1h，无水乙醇 30min 两次，脱水过程需置于低速水平摇床上进行。

（3）将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒（无水乙醇浸泡）中，将包埋盒转移至二甲苯中 5min 处理两次；

注意：每次取出时尽量沥尽残留二甲苯。二甲苯有毒性，此步骤须在通风良好区域进行。

（4）处理完成后立即转入已融化的蜡缸中，60℃ 石蜡浸透类器官 2h，换新蜡缸再浸 2h；

（5）将组织包埋盒、模具转移至包埋机的左右保存盒中。取出模具先滴入20%～30%左右石蜡，再将琼脂块放入金属模具中间位置滴蜡包埋，组织包埋盒拆开扣于顶部。

（6）包埋完成后置于冷冻台，待完全凝固后，小心脱下模具。

（7）将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为 5~8μm 厚 。

（8）将切好的切片放入摊片机，需等待至蜡片完全展开，单层无褶皱。贴到载玻片上，放于 45℃ 恒温箱中烘干。

（9）依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ5min、无水乙醇Ⅰ  5min、无水乙醇 Ⅱ 5min、95% 乙醇 5min、90% 乙醇 5min、80% 乙醇 5min、70% 乙醇 5min、蒸馏水洗 2 次。

3.类器官 H&E 染色

（1）苏木精染细胞核：切片浸入苏木精染 3～8min，自来水清洗，蒸馏水洗数秒；

（2）伊红染细胞质：切片浸入伊红染液中染色 1～3min，自来水清洗，蒸馏水洗数秒；

（3）脱水封片：将切片依次放入 95% 乙醇 I  5min 、95% 乙醇 Ⅱ 5min、无水乙醇 I  5min、无水乙醇 II  5min 、二甲苯   I  5min 、二甲苯 II  5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，滴中性树胶封片；

（4）镜检：显微镜镜下观察，图像采集分析。

4.类器官免疫染色

（1）抗原修复：用 0.01M 柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）充分浸泡样本，微波炉中低火加热修复，保持微沸状态 5 min 效果最好；

（2）封闭：封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，从而保证后续荧光染色的特异性。

（4）一抗孵育：用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例，样本加一抗 4℃ 孵育过夜。

（5）一抗洗脱：用 D-PBS 洗脱三次，每次 5min；

（6）荧光二抗：用抗体稀释液稀释荧光二抗，样本加二抗室温孵育 2 h，注意避光;

（7）二抗洗脱：用 D-PBS 洗脱三次，每次 5min；

（8）封片：用含防淬灭的中性树胶进行封片，按需可以对细胞核用 DAPI 进行染色；

（9）拍片：晾干片子后，置于显微镜下观察，获取荧光图像。

5.类器官RNA测序分析

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的纽带，转录组信息帮助科学家们揭示组织器官发育调控和胁迫适应机制、生物进化规律、疾病发生发展的重要机制以及发现致病基因调控的关键靶点。对类器官进行 RNA 测序能够评估类器官与其源组织/肿瘤基因表达谱的一致性，即这些类器官能否很好地反映其源组织/肿瘤的遗传背景、基因型和表达谱。

类器官测序前样本处理

（1）轻轻吸去培养基，各孔加入等体积基础培养基。用枪头（用 Rinsing Solution 润洗后剪去尖端）将胶滴轻轻从皿底刮除；

（2）将所有悬液转移到 1.5ml EP 管中， 用移液枪吹打 10 次，然后 4℃ 条件下 rcf 300g 离心 5min，此时会观察到离心管底部的类器官沉淀层，中间基质胶层以及培养基上清， 小心去除培养基上清与基质胶层；

（3）加入 D-PBS，4℃ 条件下 rcf 300g 离心 5min；重复此步骤三次，彻底清洗类器官；

（4）样本处理完成后，送样给第三方测序公司完成测序。