类器官培养与应用——胰岛类器官

胰腺是分泌血糖稳态激素的重要器官，是人体内控制血糖动态平衡的中心。胰腺的内分泌功能主要是由胰岛来完成的，每个胰岛都是一个复杂的微器官，由上千个分泌细胞组成。经典的胰岛内分泌细胞包括 α 细胞、β 细胞、δ 细胞、ε 细胞和 PP 细胞，分别主要产生胰高血糖素（glucagon）、胰岛素、生长抑素（SS）、生长素释放肽及胰多肽，其在成体胰岛内分别约占 20%、75%、3%～5%、1% 和＜2%^【1】。

胰岛移植为 I 型和晚期 II 型糖尿病患者提供了卓越的长期血糖控制，但是成体胰岛组织的可用量限制了这一治疗方案的广泛应用。目前诱导多能干细胞（iPSC）分化为产生胰岛素的 β 样细胞是一项重大进展。2021 年美国食品和药物管理局（FDA）已授予 VX-880（一种 iPSC 细胞在体外诱导分化而来的胰岛 β 细胞）快速通道指定，目前已启动 VX-880 的临床试验，用于治疗严重低血糖和低血糖意识受损的 1 型糖尿病（T1D）患者。在 2023 年 6 月举办的美国糖尿病协会 (ADA) 第 83 届科学会议上公布了正在进行的 VX-880 临床试验的积极结果：所有接受 VX-880 治疗的患者均在治疗前一年内胰岛素分泌检测不到，且有反复发生严重低血糖事件 (SHE) 的病史；治疗后，所有 6 名患者均表现出胰岛素分泌恢复、血糖控制改善、时间范围改善、外源性胰岛素使用减少或消除，并且在第 90 天后的评估期间完全没有发生不良反应^【2】。

类器官是一项新兴技术，与动物模型相比，类器官可以完全是人类细胞来源的；与人源器官相比，类器官更容易获得，并且可以定向分化；与组织来源的原代细胞相比，类器官独有的多细胞类型和三维培养模式，能够更好地模拟体内的结构和功能^【3】。

本篇文章基于 Nature Communications^【4-5】和 Cells^【6】发表的三篇文章，整理了人多能干细胞（hPSC）来源的胰岛样类器官培养方案。该培养过程遵循发育原理，由 hPSC 依次分化为定型内胚层 （DE）、胰腺祖细胞 （PP）、内分泌前体 （EP）， 最终诱导发育为人胰岛样类器官（human Islet-like Organoid, hILO）。

图 1. hPSC 来源细胞诱导成为胰岛样类器官的培养方案示意图^【7】

 

细胞来源

hPSC

 

培养试剂配方

	包被液	hPSC培养基	Day1	Day2	Day3	Day4-Day6	Day7-Day8	Day9-Day14	Day15-Day22	Day23-Day30	近岸蛋白产品货号
基础培养基	DPBS	Essential 8	RPMI	RPMI	RPMI	RPMI	DMEM	DMEM	DMEM	DMEM
FBS	-	-	-	0.2%	2%	-	-	-	-	-
Vitronectin	5μg/mL	-	-	-	-	-	-	-	-	-	C395
BSA	-	-	-	-	-	0.05%	0.05%	0.05%	0.05%	0.05%
Penicillin-Streptomycin-amphotericin B	-	1%	-	-	-	-	-	-	-	-
Penicillin-Streptomycin	-	-	1%	1%	1%	1%	1%	1%	1%	1%
B27	-	-	-	-	-	0.5×	1×	1×	1×	1×
N2	-	-	-	-	-	0.5×	-	-	-	-
CHIR99021	-	-	3 μM	-	-	-	-	-	-	-
Activin A	-	-	100 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml	-	-	-	-	-	C687
KGF	-	-	-	-	-	50ng/ml	50ng/ml	-	-	-	CH73
Vitamin C	-	-	-	-	-	-	0.25mM	0.25 mM	0.25 mM	0.25 mM
LDN-193189	-	-	-	-	-	-	0.1μM	0.1 μM	0.1 μM	-
GDC-0449	-	-	-	-	-	-	0.1μM	-	-	-
Retinoic Acid	-	-	-	-	-	-	2μM	-	-	-
EGF	-	-	-	-	-	-	-	50ng/ml	-	-	C029
Zinc Sulfate	-	-	-	-	-	-	-	-	10μM	10 μM
Heparin	-	-	-	-	-	-	-	-	10μg/ml	10μg/ml
616452	-	-	-	-	-	-	-	-	10μM	10 μM
T3	-	-	-	-	-	-	-	-	1μM	1 μM
Compound E( γ-Secretase-IN-1)	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1μM	-
N-acetyl cysteine	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1mM
Trolox	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1μM

 

一、hPSC 培养

1、将 hPSC 接种在 Vitronectin 包被的 6 孔板上，加入 hPSC 培养基进行扩增培养。

2、传代时加入 Accutase，将 hPSC 消化成单细胞。

3、用 DPBS 清洗两次后，接种到用 Vitronectin 包被的 12 孔板中，接种密度为 1.0 × 10⁴ 个细胞/cm²。

4、在传代培养的第一天加入含 10 mM Y-27632 的 hPSC 培养基，之后用 hPSC 培养基换液。37℃，5% CO₂ 培养 48 小时。

5、用 DPBS 清洗两次后，进入后续的分化步骤。

 

二、诱导形成胰岛样类器官

6、每天按照对应的培养基换液，培养到第 15 天时细胞聚成悬浮的小球。

7、继续按照对应的培养基换液，37℃，5% CO₂ 继续培养至 30 天。

图 2. 流式和免疫荧光鉴定。hPSC 诱导形成的 DE、PF、PP 和 hILO 能够正常表达各自的标记物^【4】。标尺，100 μm

 

可用于医学研究的胰岛样类器官

随着技术的不断进步，胰岛样类器官的发育和功能越来越接近生理条件下的胰岛组织，胰岛样类器官可以在某些场景下作为人类胰岛的替代品。

长期以来，由于动物模型不能完全模拟人的疾病特征，糖尿病研究一直缺乏真实的疾病模型。基于干细胞的胰岛样类器官忠实地模拟了胰岛的发育过程^【8】，并具有与天然胰岛相似的形态结构和细胞组成。将基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）和 iPSC 分化技术的结合，能够通过操纵胰岛样类器官来研究正常和糖尿病人胰岛的发育^【9】、功能和病理机制，在促进药物筛选和自体胰岛移植方面具有巨大前景。

图 3. 胰岛样类器官在发育机制、疾病建模和个性化医疗中的应用前景^【7】

 

 

参考文献

【1】Collombat, Patrick, et al. Embryonic endocrine pancreas and mature β cells acquire α and PP cell phenotypes upon Arx misexpression. The Journal of clinical investigation, 2007, 117.4: 961-970.

【2】Dolgin, Elie. Diabetes cell therapies take evasive action. Nature Biotechnol, 2022, 40: 291-295.

【3】Shankaran A, Prasad K, Chaudhari S, et al. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech, 2021, 11.6: 257.

【4】Ma, Xiaojie, et al. N 6-methyladenosine modification-mediated mRNA metabolism is essential for human pancreatic lineage specification and islet organogenesis. Nature Communications, 2022, 13.1: 4148.

【5】Zhu S, Russ H A, Wang X, et al. Human pancreatic beta-like cells converted from fibroblasts. Nature communications, 2016, 7.1: 10080.

【6】Choi H, Shinohara M, Ibuki M, et al. Differentiation of human-induced pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors to islet-like cells using a dialysis suspension culture system. Cells, 2021, 10, 8: 2017.

【7】Zhang, Xiaofei, et al. Islet organoid as a promising model for diabetes. Protein & cell, 2022, 13.4: 239-257.

【8】Rosado-Olivieri E A, Aigha I I, Kenty J H, et al. Identification of a LIF-responsive, replication-competent subpopulation of human β cells. Cell Metabolism, 2020, 31(2): 327-338. e6.

【9】Zhu Z, Li Q V, Lee K, et al. Genome editing of lineage determinants in human pluripotent stem cells reveals mechanisms of pancreatic development and diabetes. Cell stem cell, 2016, 18.6: 755-768.