类器官培养与应用——脑类器官
近岸蛋白
人脑是动物界中最高度发达的大脑，也是我们身体中最复杂的器官。由于其独特的复杂性，很难用动物系统来模拟人脑的发育。然而，人脑类器官现在已经成功地用于模拟人脑发育和疾病发生。人脑类器官培养是一项令人兴奋的新技术，科学家们基于模拟内源性发育过程，通过将多能干细胞（PSCs）进行诱导分化及自组装后，在体外重现了人类大脑发育的进程。最近的研究表明，脑类器官可以模拟神经发生的时空动态、区域神经回路的形成以及胶质细胞整合成神经网络。这一技术可以帮助我们探索大脑发育、新陈代谢机制，并进行药物功效测试。
由于人脑类器官的结构复杂，本文基于 Nature protocols 的方案，以背侧(hCS)前脑球体为例，简要介绍来源于 PSCs 的脑类器官培养流程【1】。
人脑类器官的培养
材料
细胞：hPSCs 或 iPSCs 细胞
主要培养基
基础培养基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，10 ng/ml FGF2）；
神经诱导培养基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，5μM DM，10μM SB，10μM Y-27632）；
神经分化培养基（主要成分：2% B27，1% GlutaMAX，20 ng/ml hEGF，20 ng/ml hFGF2，20 ng/ml hBDNF，20 ng/ml hNT3）
实验步骤
1、在涂有基质胶的平板上接种 hPSCs 或 iPSCs 细胞，并添加基础培养基进行培养，至出现明显细胞团；
2、将 30-50 个细胞团轻轻重悬于 12 ml 神经诱导培养基中，转移至 10cm 超低附着平板，将这一天记为第 0 天。将平板放在 37℃、5%CO2 的培养箱中孵育 48 小时。
3、接下来用 12 ml 神经诱导培养基(不含 Y-27632)培养 72 小时；
4、从第 6 天开始，使用添加了 20 ng/ml FGF2 和 20 ng/ml EGF 的神经分化培养基。
5、从第 12 天到第 15 天，继续每天用添加 20 ng/ml hFGF2 和 20 ng/ml hEGF 的神经诱导培养基进行培养。
6、从第 16 天开始，继续使用添加了 20 ng/ml FGF2 和 20 ng/ml EGF 的神经分化培养基进行培养，每隔一天换液一次，直到第 25 天。
7、从第 25 天到第 43 天，用 20 ng/ml BDNF 和 20 ng/ml NT3 替换神经分化培养基中的 FGF2 和 EGF，每隔 2-3 天换液一次。
8、从第 43 天开始，每隔 4 天用 17-18ml 不含生长因子的神经分化培养基换液。在正确操作下，所生成的 hCS 球体可在培养中维持培养数月。
图 1. 体外培养背侧(hCS)前脑类器官的时间线【1】
人脑类器官的应用
在过去的几年中，脑类器官系统已被广泛用于研究人类大脑疾病。由于脑类器官经历的培养与人类胎儿大脑的发育步骤相似，所以它们适用于模拟具有实际病因的神经发育障碍；同时，通过模拟脑类疾病的进展，可以实现药物的筛选。
根据统计数据，约 5% 的世界人口患有神经发育障碍。明确神经发育障碍的原因，并建立适当的临床前模型，对于开发新的治疗方法是非常重要的。小头畸形症就是使用脑类器官模拟脑部疾病的早期例子。小头症脑类器官来源于一名小头症患者的 iPSCs，该患者在 CDK5 调节亚单位相关蛋白 2(CDK5RAP2)存在突变，这被假定为小头症的风险因素。与对照组类器官相比，患者源性类器官中的极化神经前体细胞增殖减少、分化提前；此外，对照组类器官中 CDK5RAP2 的敲除导致了类似的表型，这表明 CDK5RAP2 功能的丧失是人类小头畸形症的病因之一【2】。这项研究是第一个使用脑类器官来模拟神经发育障碍的例子，并通过 CRISPR/Cas9 技术将脑类器官进行基因编辑，为人类了解脑类疾病的机制奠定了基础。
人类脑类器官模型同样为研究感染病的发病机制提供了生理学相关的平台。在 ZIKV 病毒肆虐期间，有人提出包括小头畸形在内的神经系统疾病可能与 ZIKV 病毒之间存在联系。尽管当时可以在小头畸形胎儿组织中检测到 ZIKV 病毒，但 ZIKV 可能损害大脑发育的机制仍不清楚。因此许多研究使用了 3D 脑类器官模型，揭示了 ZIKV 感染对人脑发育的影响。【3】
大脑类器官技术的历史较短，仍处于起步阶段。就细胞和分子组成而言，目前用于产生类脑器官的方案可以模仿妊娠中期左右的人类胎儿的大脑结构。由于类脑器官没有带血管的循环系统，所以它主要依靠来自培养基的简单扩散来供应气体和营养。当长时间培养时，由于缺乏氧气和营养，类器官中的大量细胞发生凋亡。2019 年，WIMMER 等人成功培养出了包含内皮细胞和外膜细胞的人类血管类器官【4】。未来的人脑类器官技术可以与血管类器官结合在一起，建立一个功能性的封闭循环系统，用以支持类器官的长期培养，并研究神经和血管的相互作用。
※Zhu团队利用近岸蛋白（Novoprotein）生产的 bFGF 因子（4ng/ml），成功培养出了人脑类器官，经免疫组化检测，PAX2（早期发育的前脑、中脑和后脑标记物）和 PAX6（前脑标记物）均有明显表达。并以此作为模型，深入研究了酒精对人脑类器官神经发生的损害，相关结果已于 2017 年发表在 Lab on a Chip【5】和 Integrative Biology【6】。
图 2. PAX2（早期发育的前脑、中脑和后脑标记物）和 PAX6（前脑标记物）均有明显表达【6】
参考文献
【1】Sloan, S. A. et al. (2018). Generation and assembly of human brain region–specific three-dimensional cultures. Nature protocols, 13(9), 2062-2085.
【2】LANCASTER, Madeline A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 2013, 501.7467: 373-379.
【3】DANG, Jason, et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell stem cell, 2016, 19.2: 258-265.
【4】WIMMER, Reiner A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature, 2019, 565.7740: 505-510.
【5】Zhu, Y. et al. (2017). In situ generation of human brain organoids on a micropillar array. Lab on a Chip, 17(17), 2941-2950.
【6】Zhu, Y. et al. (2017). Probing impaired neurogenesis in human brain organoids exposed to alcohol. Integrative Biology, 9(12), 968-978.
