类器官培养

是在体外，经过 3D 培养，能够在体外模拟正常（或疾病）状态下体内器官（或组织）的三维结构和生理功能。

通俗点讲，类器官是三维细胞培养物，将干细胞培养于基质胶中，在化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下经过培养得到的相应器官类似的组织结构。

适用于分子和细胞生物学分析，在动物和细胞水平之间，广泛应用于功能组织诱导、疾病模型建立、药物筛选、抗炎试验、临床端研究等多个方面的研究。

人多能性干细胞 ESCs/iPSCs、6 孔板、D-PBS、EDTA、Accutase、培养箱、mTeSR1 培养基、培养皿、离心管、1 ml 移液器、离心机、台盼蓝、血细胞仪或自动细胞计数仪、含 50 μM 的 ROCK 抑制剂 Y-27632 的低 bFGF 的 ESCs 培养基、含 Y-7632 的低 FGF-2 的培养基、96 孔板、Y-27632(1:100)、FGF-2、200 μl 移液器、含有 500 μl 的神经诱导培养基、含有 500 μl 的神经诱导培养基、组织培养显微镜、Matrigel 液、Parafilm 膜、剪刀、125 ml 的震动反应器、含 Vitamin A 的脑类器官分化培养液

诱导拟胚体（EB）形成（1~2 h）

1、当人多能性干细胞 ESCs/iPSCs 在 6 孔板中长到融合度为 70~80% 时用于诱导 EB，通常每个六孔板孔的细胞可用于诱导一整个 96 孔板。

对于无饲养层培养的 ESCs/iPSCs：

① 用 1 ml 的无钙镁的 D-PBS 洗涤细胞后，向每孔中加入 600 μl 的含 0.5 mM 的 EDTA 的无钙镁的 D-PBS 溶液。培养箱孵育 4 min；

② 轻柔吸出 EDTA 溶液，注意不要破坏克隆，加入 1 ml 的 Accutase。放回培养箱孵育 4 min；

③ 用 1 ml 的 mTeSR1 培养基吹散克隆，使其从培养皿底部脱落。转移 2 ml 至 15 ml 离心管中，用 1 ml 移液器将克隆吹散为浑浊的单细胞悬液；

④ 270 g 室温离心细胞 5 min，同时用台盼蓝检测死细胞，用血细胞仪或自动细胞计数仪细胞计数；检测两次取平均值；

⑤ 用 1 ml 的含 50 μM 的 ROCK 抑制剂 Y-27632 的低 bFGF 的 ESCs 培养基重悬细胞，吹打，保证细胞呈单细胞重悬的状态。然后，用含 Y-7632 的低 FGF-2 的培养基重悬细胞，使细胞浓度为每 150 μl 含 9000 个活细胞；

⑥ 每个 96 孔板孔中放入 150 μl 的细胞悬液，置于培养箱继续培养。

饲养 EB，早期胚层分化（5~7 d）

2、24 h 后，显微镜下观察，可见有清晰边缘的小的 EB 形成，边缘有许多死细胞围绕在 EB 周围，为正常现象，不会干扰 EB 在中间形成，继续置于 37 ℃ 的 5% CO₂ 的培养箱中培养；

3、隔天轻柔地吸去半量培养基，避免干扰到 EB 和底部的细胞，补充 150 μl 的新鲜培养基，培养基中添加 Y-27632（1：100），FGF-2 浓度为 4 ng/ml，直到 EB 直径大于 350~450 μm 为止，通常，仅前 4 天需要添加二者；

4、EB 直径达到 350~600 μm 时，用 3 中的培养基隔天饲养 EB，培养基中不含 Y-27632 和 FGF-2。

原始神经上皮的诱导（4~5 d）

5、EB 直径达到 500~600 μm 时，边缘开始变得明亮，并且呈现光滑的边缘（通常为第 6 天），将每个 EB 用剪掉枪头的 200 μl 移液器转移至含有 500 μl 的神经诱导培养基的低吸附 24 孔板中，继续培养；

6、转移至 24 孔板后，另外加入 500 μl 的神经诱导培养基饲养 EB；

7、2 d 后，组织培养显微镜观察 EBs，形态边缘变得更加明亮，提示神经外胚层的分化；一旦这些区域开始显示与神经上皮形成一致的假复层上皮的放射状组织，这一般发生在神经诱导培养基中的 4~5d 后，继续进行第 8 步，将神经外胚层组织转移至 Matrigel 液滴中（1~2 h）；

8、4 ℃ 下冰上解冻 Matrige；

9、将 Parafilm 膜置于一个空的带有凹坑的中号枪头盒上，将手指按向 Parafilm 膜形成凹坑，每个坑的体积约为 200 μl；

10、将 Parafilm 膜用剪刀修剪为单个含 4×4（共 16 个）凹坑大小的正方形，将其放入 60 mm 的组织培养皿中；

11、用 200 μl 的移液器转移神经外胚层组织，每个凹坑中放置 1 个；

12、用未剪头部的 200 μl 移液器小心地吸去组织边缘多余的培养基；

13、每个组织快速滴入 Matrigel，每孔约 30 μl，使 Matrigel 滴入 Parafilm 凹坑中；注：快速滴入 Matrigel，避免组织干掉。尽量一次性滴入 Matrigel，一次性包埋好 16 个组织；

14、用 10 μl 的移液枪头移动组织，使组织位于液滴的中央，这一步需要在滴入 Matrigel 后立即进行，因为室温下 Matrigel 非常容易固化；

15、将此 60 mm 培养皿置入 37 ℃ 培养箱中，孵育 20~30 min 以使 Matrigel 聚合；

16、取出 60 mm 培养皿，加入 5 ml 不含 Vitamin A 的脑类器官分化培养基；

17、将 Parafilm 膜反过来并摇动培养皿，直至 Matrigel 液滴从凹坑中滴入培养基中；不容易脱落的液滴可以用镊子用力晃动 Parafilm 膜使其脱落，将培养皿置于培养箱中继续培养组织。

神经上皮芽的固定培养（4 d）

18、24 h 后，观察包埋的组织，1~3 d 内，组织会呈现包含液体空腔的进一步扩张的神经上皮样；

19、将液滴继续培养 24 h，然后将培养基更换为不含 Vitamin A 的脑类器官分化培养基，继续培养 48 h。

脑组织的生长（~1 年）

20、4 h 的静止培养后，用开口约为 3 mm 的剪去头部的 1 ml 移液枪头将包埋好的类器官转移至 125 ml 的震动反应器中，加入 75~100 ml 的含 Vitamin A 的脑类器官分化培养液，将此生物反应器放置在培养箱中安装的磁搅拌板或轨道振动筛上用 85 rpm 的速度震动。

21、振动筛上的类器官每 3~4 天全量换液，摇瓶上的类器官每周换液，注意观察形态；在合适的时间点取样本用于实验研究；

1、干细胞克隆的形态对于大脑组织形成的成功与否非常关键。克隆需呈现多能性的特征 （如边缘清晰，克隆紧密等），且无分化倾向；
2、操作轻柔且不要破坏 EB；
3、将 200 μl 移液器枪头剪掉时使开口直径约为 1~1.5 mm。确保开口不要太小，避免破坏 EB，但也不能太大，太大会难以吸去 EB。不要试图用刮刀将 EB 铲出，会破坏 EB 的结构；
4、观察发现，500 μl 的 Matrigel 在冰水混合物浴时，1~2 h 后会恢复液体状态；
5、Parafilm 不能高压灭菌，所以不能彻底灭菌，因此需保证 Parafilm 膜保存在干净的环境中，准备凹坑前，向手套和 Parafilm 膜喷洒 70% 乙醇消毒；在这一步也可以在培养基中添加抗生素以避免污染；
6、从 Matrigel 主体中会迁移出一些细胞类型，通常呈成纤维细胞样，这些细胞代表了非神经特性的群体，从神经诱导时逃脱出来；然而这些细胞通常不能生存，且迁移出来后，对神经上皮芽的形成呈现促进作用；
7、换液时，倾斜培养皿使液滴下沉，轻柔吸出培养液。尽量在不破坏类器官的情况下，吸出更多的培养液。更换为 5 ml 的新鲜培养液。