贴壁细胞传代

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细胞培养 （Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。

对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为 （以下操作均按无菌操作的要求进行）：

将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润； 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化； 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。 下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。

所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10％小牛血清的DMEM -F12，倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。

取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml培养基，同上静置培养。

经24小时培养后，生长情况为：

经48小时培养后，细胞已长成致密单层：

致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明：

弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。

加入2.5%胰酶后，细胞逐渐皱缩变圆，细胞间隙增大不再致密：

刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：

细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：

细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆：

细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：

细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：

有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。

如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。

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