方案13.3 悬浮细胞传代

从悬浮细胞培养物中吸取样品，细胞计数，接种适量的悬浮细胞至新培养瓶的新鲜培养基中，使细胞浓度与开始培养时一致。

起始培养物、生长培养基、吸管、离心管

培养瓶、搅拌瓶、移液器、吸耳球

吸水纸巾、吸管桶、抗乙醇记号笔

血细胞计数板

1. 准备好超净台，将试剂及材料放于超净台上准备开始实验。

2. 仔细检査培养物有无污染或衰退迹象。这一步骤对于悬浮培养物来说比单层贴壁细胞更难，细胞状态不好时表现为皱缩，外形不规则和（或）颗粒化。健康的细胞干净而透明，在相差显微镜下核清晰可见，而且静置培养时常常可见小细胞团。

3. 将培养物（起始培养物：HL60、L1210 或 P388，以 2×10⁴ ml 接种在 25 cm² 培养瓶中 7 天和 14 天）放至无菌工作区域，从中取样，细胞计数。

4. 根据上文所述的悬浮培养物传代标准及对该培养物行为特征的了解决定是否传代。若需传代，进行下述步骤。

5. 混匀细胞悬液，通过上下吹打使小细胞团分散。

6. 加 50 ml 培养基（生长培养基，如 S-MEM 或 RPMI 1640，加 23 mmol/L NaHCO₃，5% 小牛血清）至 2 个新搅拌培养瓶。

7. 在 4 个 25 cm² 瓶中各加 5 ml 培养基。

8. 向各瓶中加人足量细胞。对于生长缓慢的细胞（倍增时间 36~48 h ） 终浓度达到 1×10⁵ /ml ，对于快速生长的细胞（倍增时间 12~24 h ） 终浓度达到 2×10⁴ /ml。

9. 用 5% CO₂ 向瓶中吹入气体。

10. 盖上培养瓶，放置于孵箱。向单层细胞一样，培养瓶平放。

11. 盖好搅拌瓶，在培养箱或 37 °C 温室中，放在磁力搅拌器上，以 60~100 rpm 的转速旋转。注意搅拌马达不要使培养物过度升温。若必要可在瓶底部加放聚苯乙烯泡沫垫子。电磁感应的搅拌器产热低且无可移动部件。