贴壁细胞传代-消化过程(图示)

贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。

对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为 （以下操作均按无菌操作的要求进行）：

将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；

加入0.25%胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；

一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；

视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。 下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。

所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10%小牛血清的DMEM-F12，倒置显微镜10X40，数码相机300万像素。

取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml培养基，同上静置培养。

经24小时培养后，生长情况为：