江湖救急！谁能写一下，超详细的DF-1细胞培养过程啊？？

1.准备工具和试剂

DF-1细胞

贴壁细胞培养瓶

完全培养基：DMEM（高糖）培养基，含10%胎牛血清（FBS），1%青霉素-链霉素溶液

DPBS（不含钙、镁）

细胞刮刀

离心机和离心管

显微镜

无菌操作台

2.培养前的准备

将培养瓶和培养基从冰箱和冰柜中取出，分别放入37℃恒温箱中和室温下复温。

配制好的完全培养基在37℃恒温箱中加热30-60分钟，使培养基达到37℃。

3.细胞传代

将离壁的细胞吸入离心管中，然后离心5分钟，1500 rpm（约200-300g），收集细胞。

轻轻弹击离心管，将细胞颗粒悬浮在上清液中，再弃去上清液。

向离心管中加入1-2ml预热的完全培养基，轻轻吹打以使细胞充分悬浮均匀。

计算细胞浓度并根据实验需要进行细胞分裂。通常，DF-1细胞可以以1:3至1:6的比例进行传代。

将所需数量的细胞接种到新的贴壁细胞培养瓶中，并加入适量的完全培养基。

将细胞培养瓶平放于37℃，5% CO2恒温培养箱中进行培养。

4.细胞培养及维护

每天观察细胞生长状况，如细胞形态、密度等。

当细胞生长至约80-90%时进行下一次传代。根据细胞生长速度，通常需要2-3天进行一次传代。

如果细胞生长缓慢或出现形态异常，请检查培养条件、培养基成分或者考虑细胞可能的污染情况。

DF1培养过程如下：

一．培养基及培养冻存条件准备：

　　1） 准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗 1%

　　2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

　　3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　二．细胞处理：

　　1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

　　2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2）加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

　　3）轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加1-2mL培养液后吹匀。

　　4）将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

　　3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

　　1）细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

　　2）4min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

　　3）将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。