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sswei
1,将前期扩的产物稀释后做模板,再PCR。
2, 更换引物,将引物设计位于ATG之前,也就是去扩增mRNA片段,然后以它为模板稀释后扩增CDS区
3, 更换Taq酶,普酶换高保真,高保真换普酶等。
loveliufudan
如果在克隆中一直无法得到目标条带,可能有几个原因导致:
1. 低表达水平:如果目标基因的表达水平非常低,可能导致在cDNA克隆中很难获得足够的目标序列。在这种情况下,可以尝试增加反应的RNA数量、增加逆转录反应的循环数或使用增强型逆转录酶。
2. PCR条件优化:检查PCR反应条件是否正确设置,包括引物浓度、扩增温度和循环数。可能需要进行一系列的优化实验,尝试不同的条件,以获得所需的目标条带。
3. 引物设计问题:确保使用的引物与目标基因序列匹配,并具有适当的特异性。重新设计引物,确保其在目标基因上有良好的特异性,避免与其他相关基因发生非特异性扩增。
4. 高度变异的基因:某些基因具有高度变异的序列,这可能导致引物与目标基因不完全匹配,导致扩增失败。在这种情况下,可能需要重新考虑目标基因的克隆策略,例如使用其他方法如基因组测序或荧光原位杂交等。
5. 考虑其他克隆方法:如果持续遇到困难,可以考虑其他的克隆方法,如聚合酶链反应(PCR)克隆、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、基因组测序等。
huarenqiang5
1、将你前期扩的63°的产物稀释后做模板,再PCR。
2、更换引物,将引物设计位于ATG之前,也就是去扩增mRNA片段,然后以它为模板稀释后扩增CDS区。
3、更换Taq酶,普酶换高保真,高保真换普酶等。