功能基因cDNA3'末端的克隆
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一.原理
(1) 以目的mRNA 为模板,使用Oligo dT-3sites Adaptor Primer 进行反转录反应,合成1st Strand cDNA。
(2) 使用含有KpnI、XbaI、BamH I 酶切位点的上游特异性引物和3sites Adaptor Primer进行PCR反应。
(3) 使用限制性酶(KpnI、XbaI或BamH I)对PCR产物进行酶切反应。
(4) 选用适当载体克隆PCR产物并进行DNA测序。
二.材料与方法
1 材料
肝脏RNA
2 仪器、用具
PCR仪、0.2mlPCR管、移液器
3 试剂
(1) RNase Free H 2 O;10×RNA PCR Bμffer;MgCl2(5mM);RNase Inhibitor(40μ/μl);Oligo dt-3sites Adaptor Primer(2.5μM);AMV Reverse Transcriptase XL(5μ/μl)
(2) ddH 2 O;10×PCR Bμffer;MgCl 2 (25mM);3 sites Adaptor Primer(20μM);TaKaRa Taq酶
4 方法
(1) 1st strand cDNA的合成
反应条件:30 ℃ 10min;55℃ 30min;95℃ 5min;5℃ 5min。
(2) PCR反应
① 1st PCR反应
a. 反应体系:
b.按以下条件进行反应:PCR扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94 ℃ 变性1 min ,55℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后 72 ℃ 再延伸5 min。
② 2nd PCR
a.反应体系:反应
b.按以下条件进行PCR反应:PCR扩增反应条件:94℃预变然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94 ℃ 变性1 min,1min,72 ℃ 延伸1 min;循环结束后72 ℃延伸5 min。c.反应结束后,取 PCR 反应液(5-10μl)进行琼脂糖凝胶电。
(3) 将2nd PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳pMD-18T载体,进行鉴定和序列分析(方法同实验六、实验七)。
(4) 获得cDNA 3’末端序列后,将其与cDNA 的核心片断进行序列拼接。