双链cDNA末端补平
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1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega): 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml) 2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟; 3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟; 4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟; 5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA; 6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA; 7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟; 8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味. 注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。 PCR纯化试剂盒操作流程: 1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。 2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。 3.加入spin column中,13000rpm离心1min。 4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。 5.13000rpm,再离心1min。 6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。 7.13000rpm离心2min。 8.加入30ul buffer EB,静置10min。 9.13000rpm离心2min。 10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。 (责任编辑:大汉昆仑王) |