cDNA 扩增和影印

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保存于细菌中的克隆纯的、已测序确证的人 EST 序列
LB 培养基 超级肉汤培养基 乙醇 裂解液 RNA 酶溶液 缓冲液 乙醇 乙酸溶液 丁二酸酐 1－甲基－2－吡咯烷酮 硼酸钠
离心机 96 孔热循环仪 水浴锅 微量滴定板清洗仪

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 将密闭的克隆纯的、已测序确证的人 EST 母板在 37℃ 培养过夜。

2. 取多套标准圆底 96 孔板，全部做好标记，每孔加入 100 ul 添加了 100 ug/ul 羧苄青霉素的 LB 培养基准备复制。

为保存母板，第一次复制母板时应该多重复几套平板作为工作平板。应该核对这些 EST 克隆是装在青霉素抗性的载体里，一般入 IMAGE 克隆都是这样的。

3. 打开前将母板在 20～25℃ 下以 167 g 轻微离心 2 min （在水平培养板转子上是 1000 r/min）， 以除去盖子上凝聚的水汽或液滴。

4. 用 100％ 乙醇把容器装满一半，将 96 针多点复制器浸入再取出，然后点燃复制器上的针。

5. 待复制器冷却后，将它伸进母板，然后取出伸进对应的 LB 子代培养板。如有必要，可多重复接种几板。

6. 将接种后的子代 LB 培养板盖好盖子，放进装有湿纸巾的 1 gal 可密封储存袋中 37℃ 培养过夜。

7. 向 96 孔深孔板每孔加入 1 ml 含有 100 ug/ul 羧苄青霉素的超级肉汤培养基。

8. 用 96 点复制器从新鲜培养的 LB96 孔板接种到深孔板。

9. 用多微孔胶带封住深孔板的口，再盖上塑料盖。将培养板放到水平摇床上，37℃，200 r/min 培养 24 h。

10. 往即将冻存于 -80℃ 作为接种源的工作平板上每孔加入 45 ul 45％ 的灭菌甘油。

11. 把裂解缓冲液（裂解小抽试剂盒）在 37℃ 加热至 SDS 溶解。

12. 往 100 ml 重悬缓冲液（裂解小抽试剂盒）里加入 1 ml RNA 酶，并存放在 4℃。

13. 准备好 96 孔收集板（裂解小抽试剂盒），往每孔加入 350 ul 100％ 的变性乙醇。把过滤板放在收集板上面并用胶带固定。

14. 在配有 96 孔板水平转子的离心机上，于 20～25℃ 以 1500 g 将深孔板细菌培养液离心 7 min。

15. 轻轻倒掉上清，并将剩余培养基倒在干净的纸巾上。

16. 用 100 ul 重悬缓冲液重悬沉淀。涡旋仪振荡直到所有沉淀彻底重悬。

17. 加入 100 ul 裂解缓冲液。从侧面晃动培养板轻轻混匀；避免剪切力弄断细菌染色体 DNA。

18. 每孔加入 100 ml 沉淀缓冲液，快速混匀后加入 100 ul 中和缓冲液，涡旋仪振荡。

19. 用试剂盒附带的宽口枪头将深孔板内容物转移到先前准备好的过滤板/收集板叠堆。

20. 将叠堆板在 20～25℃，1500 g 离心 12 min。

21. 将它们从离心机上取下，抛去过滤板。将收集板中的乙醇和滤过液倒掉，用干净的纸巾轻轻吸掉剩余的乙醇。

22. 每孔加入 500 ul 70％ 乙醇，立即倒掉。用干净的纸巾轻轻吸掉剩余的乙醇。

23. 将收集板放入干净的抽屉，不盖盖子，只覆盖一层干净的纸巾，放过夜晾干。

24. 用 200 ml T low E 缓冲液重悬 DNA。用灭菌的 96 孔板盖子盖好。使用前在 4℃ 至少放 2 天重新水合（rehydrate）。储存于 -20℃。

25. 每个待扩增的 96 孔板，配置含有下列组分的 PCR 反应母液：

1000 ul 10×PCR 缓冲液

20 ul 100 mmol/L dATP

20 ul 100 mmol/L dGTP

20 ul 100 mmol/L dCTP

20 ul 100 mmol/L dTTP

5 ul 1 mmol/L AEK M13F 引物

5 ul 1 mmol/L AEK M13R 引物

100 ul 5U/ ul Taq DNA 聚合酶

8800 ul H₂O

26. 标记好 96 孔 PCR 板，每孔加入 100 ul PCR 反应母液。轻轻弹动板壁确定没有气泡压在孔底。

27. 每孔加入 1 ul 纯化的 EST 质粒模板。确保每次加入模板时枪头尖伸进反应混合液中。

28. 按下列热循环程序工作：

PCR 结束后，板子存放在 4℃，此时进行质量控制检查。

29. 倘若此次为这些 EST 的第一次扩增，每个 PCR 取 2 ul 跑 2％ 的琼脂糖胶并选用合适的分子质量标准物。如果这批模板先前扩增过，则每个板取一排跑胶检查。

30. 每个扩增板选一排扩增产物，各取 1 ul 用荧光仪分析。

31. 取 V 型底 96 孔细胞培养板，每孔加入 200 ul 乙醇/乙酸溶液（pH 6）。

32. 每孔 PCR 产物（步骤 28）取出 100 ml 加到对应的 V 型底 96 孔板并吹吸混匀：吸 75 ul， 然后吹出；如此 4 次。

33. 将板子置于 -80℃ 放 1 h 或-20℃ 过夜。

34. 将板子融化冰块以减少脆性并使孔内可能形成的冰完全融化。

35. 4℃ 条件下 2600 g 离心 40 min。调整微量滴定板清洗仪吸取上清，使约 10～20 ul 留在孔底。

36. 用清洗仪每孔加入 200 ul 70％ 乙醇清洗沉淀。

37. 4℃，2600 g 离心 40 min。用清洗仪吸取上清。板置关闭的抽屉里晾干过夜。

38. 每孔加入 40 ul 3×SSC。用锡箔纸封好，确保每个孔都封紧。

39. 将 3×SSC 浸湿的纸巾与平板一同放入热密封袋并用加热封口仪封好袋口。

40. 将袋子放入 65℃ 培养箱 2 h，然后关掉培养箱加热。

41. 每板选一排孔各取 1 ul 重悬的 PCR 产物，跑 2％ 的琼脂糖胶。

充分地沉淀和重悬将产生很强的条带，没有停留在加样孔或从条带到加样孔的拖带。

42. 把重悬后的平板放在-20℃。

将 PCR 产物从滴定板转移到玻片上的点样仪（printer） 和针（pen） 的品种很多，其应用可在很大程度上避免繁琐的点样过程。下面的步骤对这一过程作了大略的描述。

43. 按厂家的说明书清洗针。

44. 安装带有多聚赖氨酸封闭玻片的点样仪玻片架。

45. 将装有纯化 EST 的 PCR 产物的板子解冻，在 20～25℃ 以 167 g 轻微离心 2 min （在水平培养板转子上是 1000 r/min）， 以除去盖子上凝聚的水汽或液滴。

46. 取 5～10 ul 纯化的 PCR 产物到另一个平板用作点样溶液。

带羽管状针的点样仪一般需要点样溶液足够低，这样当点样针下降到孔里的时候，它浸入液面的深度＜1 mm。这样针旁边带出来的液体不会太多，不至于在开始的几个片子上产生有差异的又较大的点。

47. 设计一个可重复的点样试验来检验点位模式的大小和形状，以及在玻片上的放置位置。

48. 如果一个或者多个针头达不到期望的水平，重新清洗或者换一个新的再试。如果所有的针都正常，就完成所有的点样。

49. 点样结束后拿走玻片，用金刚笔在玻片边缘刻上点样的识别符和玻片编号。放在无尘的玻片盒里，可以放 1 周。

50. 把玻片点样面朝上放入耐热玻璃烘烤盘用塑料膜盖住，置交联仪以 450 mJ 能量紫外光曝光。

51. 将玻片装入 30－玻片不锈钢架，再将玻片架装入玻璃罐。

52. 在装有 325 ml 1－甲基-2-吡咯烷酮的大玻璃烧杯中用磁力勝棒搅拌溶解 6.0 g 丁二酸酐。

53. 往烧杯中加入 25 ml 1 mol/L 硼酸钠缓冲液（pH 8.0）。让溶液混合几秒钟，然后快速倒进玻片罐。

54. 将玻片罐置于通风橱内的水平摇床上摇 20 min， 每分钟 70～90 次。

55. 玻片在摇床上温育的同时，准备开水以变性玻片上的 DNA。

56. 玻片摇床温育 20 min 后转入开水浴。当玻片一没入开水时立即关闭加热装置。开水浴 2 min 。

57. 将玻片转入装有 100％ 乙醇的玻璃罐孵育 4 min。

58. 将玻片拿去在 20～25℃ 以 167 g 轻微离心 2 min （在水平培养板转子上是 1000 r/ min）， 用干玻片。

59. 杂交前将玻片保存于一个干净、无尘的玻片盒，放过夜。

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操作 1－甲基－2－吡咯烷酮（致畸剂）时应戴腈制（Nitrile） 手套，并在化学通风橱中工作。

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1. 材料

保存于细菌中的克隆纯的、已测序确证的人 EST 序列（例如，gf211 release， Research Genetics）

2.试剂

LB 培养基（Biofluids），内加 100 ug/ul 的羧苄青霉素（母液 100 mg/ ml）

70％ 乙醇

100％ 变性乙醇（denatured ethanol）

超级肉汤培养基（Biofluids） 内加 100 ug/ul 的竣苄青霉素（母液 100 mg/ml）

45％ （m/V） 甘油（酶级，高压灭菌，室温存放）

96 孔碱裂解小抽试剂盒（Edge BioSystems）

裂解液

RNA 酶溶液

重悬缓冲液

96 孔收集板和过滤板

沉淀缓冲液（存放于 4℃）

中和缓冲液（存放于 4℃）

宽口吸头

深孔板

T low E 缓冲液

10×PCR 缓冲液

100 mmol/L dATP

100 mmol/L dGTP

100 mmol/L dCTP

100 mmol/L dTTP

1 mmol/L PCR 引物 AEK M13F （5’－GTTGTAAAACGACGGCCAGTG －3‘）

1 mmol/L PCR 引物 AEK M13R （5’－CACACAGGAAACAGCTATG －3‘）

Taq DNA 聚合酶 （AmpliTaq， PE Biosystems）， 存储于 -20℃。

乙醇/乙酸溶液

20×SSC

丁二酸酐（Sigma－Aldrich）

1－甲基－2－吡咯烷酮（1－methyl-2－pyrrolidinone）

1mol/L 硼酸钠，pH 8.0

3.耗材

96 孔圆底和 V 型底塑料细胞培养板（Corning）

带有水平微孔板架，容得下 6.2 cm 深，可离心微孔板和过滤板的离心机（如 Sorvall Super T21， Sorvall 带 ST－H750 微孔板架的转子）

96 针多点复制器（96－uln multi－dot replicator）

家用 1 gal 可密封储存袋（如 Glad Lock）

深孔板

多微孔胶带（如 Qiagen 的 Airpore Tape Sheets）

37℃ 可以放置深孔板的控温台式摇床

灭菌的 96 孔板盖（如 Elkay Products）

薄壁 96 孔 PCR 板和 PCR 板盖子（如 Robbins Scientific 公司的 CycleSeal 盖子）

96 孔热循环仪（MJ Research 公司）

微量滴定板清洗仪（如 Bio－Rad 公司 Immunowash Microplate washer）

热密封储存袋和加热封口仪

65℃ 水浴锅

玻片点样仪（如 GeneMachines、Genetic Microsystems、Genetix、Cartesian Technologies）和点样针（如 Majer Precision Engineering、TeleChem International）

在玻片上刻字的金刚石

没有纸或软木衬垫的塑料玻片盒（如 PGC Scientifics）

约 24 cm×34 cm×5 cm 耐热玻璃烘烤盘

多聚赖氨酸封闭的玻片

30－玻片不镑钢架和 30－玻片玻璃罐（Shandon/Lipshaw）

1L 玻璃罐

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