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cDNA文库组标准流程八:pBlueScript cDNA库扩增

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1768

 

1 .试剂及配方:

2 x LB (1升):

        20g    氯化钠

        20g    蛋白提取物

        10g    酵母提取物

      加入蒸馏水至1升,用NaOH调pH值至7.0,高压灭菌

2 x LB-甘油(12.5%)(200ml)

175ml  2 x LB液体

25ml   甘油(100%)

加入蒸馏水至200ml,压灭菌,置于4℃备用

 

2 .步骤

1.将cDNA文库转入大肠杆菌,如DH5a(DH10B) 后,取少量菌液涂布氨苄平板,以推算克隆总量。

2.取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体,每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆,可以适当增加2 x LB液体的量,但不能少于此比例

3.按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose

4.70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟.

5.37℃放置1小时

6.加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml

7.加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡

8.将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面

9.轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时

10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心10,000g ,20分钟,必须室温

11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB-甘油(12.5%)重悬.

12.将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存

13.取1ul扩增后菌液倍比稀释.

14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.

 

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