为什么连接之后转大肠杆菌之后做菌落pcr老是没有目的条带，引物验证了都没有问题，克隆这一步都是能克隆到目的片段的

有标记基因吗？有的话看在筛选培养基上是不是能生长，能的话就没问题，直接进行下一步，没有的话提取大肠杆菌基因组，用你的引物进行pcr克隆验证

您的实验中连接和克隆目的片段这一步都顺利进行，但在大肠杆菌中扩增后没有出现目的条带。这可能是由以下几个原因导致的：

1. 质粒提取和纯化问题：从大肠杆菌中提取和纯化质粒时，可能存在提取不完全或质粒纯度不高的问题。这种问题会导致PCR扩增时目的片段不能被检测到。尝试优化质粒提取和纯化的方法。

2. 引物特异性问题：尽管您验证了引物的特异性，但在实际操作中，引物可能仍存在一定的特异性问题。可以考虑重新设计引物或采用其他方法来验证引物的特异性。

3. PCR反应条件：在PCR实验中，反应条件可能对扩增效果产生很大影响。尝试调整PCR反应条件，如退火温度、循环次数等。

4. 模板量问题：模板量可能对PCR扩增效果产生影响。尝试增加模板量，以提高扩增效率。

5. 酶活力问题：使用的Taq DNA聚合酶可能存在活力不足的问题。可以尝试更换来源可靠的酶或重新制作酶溶液。

6. 仪器问题：PCR仪器可能存在操作不当或故障问题，导致实验结果不准确。可以尝试检查仪器操作是否正确，或更换其他仪器进行实验。

7. 电泳和凝胶染色问题：电泳过程中可能出现问题，导致结果不准确。可以尝试调整电泳条件或使用新的凝胶。同时，检查凝胶染色方法是否正确，以确保目的条带可以被检测到。

通过优化实验条件、检查实验操作和仪器等方面，可能可以提高实验的成功率。同时，多尝试几次实验，以便找出可能导致问题的具体原因。

可能是转的菌太少了，建议增加转菌量

1.可能连接没有成功 2.可能pcr退火温度不合适 3 可能酶切没切开

很有可能你的菌是假阳性的菌哦。

1克隆没做成功,目的片段没连到载体

2试剂可能有问题,比如引物过期,mix有问题等 建议菌液提质粒再检测一下