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固定化金属亲和层析实验
总结IMAC的应用领域,包括蛋白质分级分离和蛋白质组学、蛋白质固定和检测,以及一些特殊应用,如免疫球蛋白的纯化和Chelex方法。 作者: 伯吉斯等,主译:陈薇,本实验来自「蛋白质纯化指南」
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疏水作用层析在蛋白质纯化中的理论及应用实验
疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography, H I C )是蛋白质纯化技术中一个非常有价值的工具。 H I C 用于蛋白质纯化的规模很广泛—分析及制备规模均可。H I C 可用于去除溶液中存在的多种杂质,包括不需要的产品相关杂质。尤其 是 ,H i c 于去除产品巾的聚 合 讽 ,目 其 与 轉 财 特 性 不 H 般 可以有效去除。本章中,我 们
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亚细胞器及亚细胞结构的分离实验
在蛋白质组学的研究中,所有富集技术的一个关键步骤是亚细胞的分级分离,它对于胞内细胞器和多蛋白质复合物的分析是尤其重要的。为了降低样品的复杂性,亚细胞的分级分离应采用一种灵活的和操作性强的方法来进行,且与高分辨率的2D 凝胶/质量光谱法,或独立的凝胶技术联合使用时才能达到最佳效果。 作者: 伯吉斯等,主译:陈薇,本实验来自「蛋白质纯化指南」
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毕赤酵母中的表达实验
毕赤酵母已经成为重组蛋白生产最常用的酵母菌。它在蛋白质表达方面的有点包括:具有高效且受严格调控的启动子,强烈的倾向于呼吸生长,而不是发酵生长。详细介绍利用毕赤酵母进行基因表达时涉及的一些具体操作。 作者: 伯吉斯等,主译:陈薇,本实验来自「蛋白质纯化指南」
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用插入诱变法分离突变体实验
酵母细胞中有两种微管结构,它们在生命周期中具有不同的功能。核微管作为核内有丝分裂纺锤体的主要组分,在染色体分离中起作用。胞质微管在子代细胞间的核定位和交配(同性配子的互相融合)中的核融合过程中起作用。缺失胞质微管的突变体可存活,而缺失核微管的突变体不能存活,这提示微管的重要功能在于染色体的分离。
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细胞型操作实验
根据交配型的稳定性可以将菌株分为两组,即异宗配合型(heterothallic) 与同宗配合型(homothallic)。异宗配合型菌株的交配型是稳定的,而同宗配合型单倍体菌株的交配型能够发生交配型的改变。所以,一个来自同宗配合型细胞的菌落将同时含有 a 和《细胞以及 a 和 a 细胞交配产生的二倍体细胞。
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合成致死突变体实验
ura3Δ0 和 leu2Δ0 是完全缺失,并且等位基因是在基因 HJS3 内部的 187bp 碱基的缺失。所有其他可读框的缺失是通过一步基因置换法来构建的,它采用了聚合酶链式反应(PCR) 来源的片段和 pFA6a 质粒家族的 G418 抗性(G4180 区。每个缺失都是在二倍体中构建的,以便结果是杂合体菌株。
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营养缺陷型、温度敏感型和渗透压敏感型突变株的分离和鉴别实验
为了鉴别特定的能生长在完全培养基但无法在基本限定培养基上生长的营养缺陷型突变株,将待测突变株转到补充不同氨基酸、嘌呤、嘧啶和其他代 1T 物的 9 种基本培养基平板上。通过观察特定菌株在这些平板上的生长情况,就可以鉴别出突变菌株生长所需要的特定条件。
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由沉默慢病毒载体 产生的基因下调小鼠实验
这一章描述利用慢病毒载体转移基因和小干扰RNA (siR N A )表达盒到胚胎植人前的晶胚。这一技术使快速转基因动物和转基因下调动物快速发展 作者:T.弗里德曼等,译者:殷勤伟等,本实验来自「基因转移」
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酵母细胞的观察实验
它们的很多重要特征在光学显微镜下都能够观察到。在实验室中,最好定期在相差显微镜下观察酵母培养物,以掌握细胞的生理状态以及污染情况。很多现代酵母细胞生物学研究采用复杂检测方法,用蛋白质特异抗体或特异结合某些细胞器的荧光染料对酵母细胞染色,近来,开始使用绿色荧光蛋白(GFP) 与感兴趣的酵母蛋白进行融合来标记细胞。本实验会提供一些将光学显微镜用于酵母细胞检测的标准类型例子。
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原核显微注射技术实验
描述了用原核显微注射制备转基因小鼠的技术。原核显微注射,包括注射DNA到单倍体原核受精卵,是一个已被广泛接受的技术。构建转基因鼠可用简单的启动子/cDNA, 也可用大的包含基因组片段的载体,如黏粒、酵母人工染色体(YAC) 、 细菌人工染色体(BAC) 。 作者:T.弗里德曼等,译者:殷勤伟等,本实验来自「基因转移」
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用特洛伊木马脂质体进行可穿过血脑屏障的非病毒基因转移实验
通过静脉注射特洛伊木马脂质体(Trojan horse liposome, T H L , 也 称 为 P E G y -Iates免疫脂质体, P I L ) 包裹的DNA, 非病毒载体质粒DNA可经血管途径穿过血脑屏障传送人脑。 IOOnm的脂质体表面覆盖着数千个多聚体,如 2000D a 的聚乙二醇(P E G ) , 或 称 P E G 2000。 1 % 〜2 % 的 P E G 分子末
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利用模块装配方法构建锌指 核酸酶以位点特异的方式操作基因组实验
同源重组是基因组操作中最精确的一种方法。作为一个工具,同源重组已经广泛地用于细菌、酵母、鼠胚胎干细胞(E S ) , 以及其他一些特殊细胞系,但在其他系统如哺乳动物体细胞遗传学上还没有得到应用。最近的研究工作表明,在哺乳动物体细胞中,双链 D N A 发生基因特异的断裂,能够引起上千倍的同源重组。目前,利用锌指核酸酶(Z F N ),能够在哺乳动物基因组中形成这种双链断裂。 Z F N 是一种人工
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嗜菌体 ΦC31 整合酶介导的位点特异性整合实验
有效地传递ΦC31整合酶和供体质粒到感兴趣的受体组织或细胞仍然是这一整合系统中最具挑战性的内容。不像利用病毒的方法对基因组进行操作,用 ΦC31整合酶几乎总是需要一个额外的方法来刺激细胞对DNA 的摄取。然而,相对简单的质粒系统意味着几乎所有已证明的可行的导人外源DNA 进入细胞的方法都能够用 ΦC31整合酶来实现。事实上,多种转染技术有时显示出适合于这方面的应用。作者:T.弗里德曼等,译者:殷勤
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米非司酮诱导的基因调节系统实验
米非司酮诱导的基因调节系统(M I G R S ) 是通过抗孕酮药—米 非 司 酮 (M f p )来调控耙基因表达的体系。该体系利用一种反式激活嵌合蛋白质,此蛋白质重组了部分人孕酮受体的配体结合区(hPR-LBD)、源于酵母Gal4 转录因子的D N A 结合区以及反式激活区。在没有内源性孕酮存在的情况下, M f p 作为一种反式激活子结合于祀基因启动子内上游区域的激活序列,并启动靶基因转录。
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生物可降解的纳米颗粒实验
生 物 可 降 解 纳 米 颗 粒 是 一 种 胶 体 颗 粒 ,一 般 直 径 在 IOOnm左 右 ,可 以 由 聚 乳 酸 -聚经 基 乙 酸 (P L G A ) 或 聚 乳 酸 等 生 物 可 降 解 聚 合 物 制 备 而 成 。这 些 纳 米 颗 粒 通 过 内 吞 作用 进 人 细 胞 ,并 且 研 究 证 明 它 们 可 以 快 速 从 溶 酶 体 逃 逸 ,从 而 保 护 纳
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用于核酸传递的含环糊精的聚阳离子
大量非病毒体系已经被用于体外培养细胞或体内特定细胞的核酸传递。它们在毒性、免疫原性和靶向特定细胞表面受体或细胞种类的能力等方面具有很大差异。 一 类含有 P-环糊精的线性阳离子聚合物在体内核酸传递中展现出了良好的效果,这些核酸包括质 粒 D N A 、 D N A z y m e 和小干扰R N A 。这类聚合物和核酸形成复合物(p〇 lyP lex),并且可以进一步进行靶向配体(如转铁蛋白)的修
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用于基因传递的聚赖氨酸共聚物
聚赖氨酸及其共聚物作为非病毒类基因载体获得了广泛的应用。尽管聚赖氨酸本身对细胞具有毒性,但通过共价键将聚乙二醇连接到聚赖氨酸链段后,细胞毒性大大降低 ,并且可以增加基因转染效率。我们还合成了可降解的聚赖氨酸的类似物聚氨丁基乙醇 酸 (polyaminobutyl glycolic acid),以及十八 焼 基 化的聚赖氣酸 (Stearylpolylysine)用于传输D N A ,后者与低密度蛋
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基因组靶序列荧光原位杂交探针的标记实验
荧光原位杂交(FISH)需要核酸探针,包括直接用荧光素标记或者可以间接与荧光素相连接的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或核酸类似物。通过探针核苷酸与靶序列的核苷酸互补配对,使得FISH分析具有特异性。核酸连接的荧光基团使得在荧光显微镜下可观察到细胞结构中的同源区域。摄影照相或电子照相可获得永久性荧光染色图像,而且后者可以进行探针荧光的定量测定。
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传递基因进皮肤的基因枪技术
基 因 枪 技 术 是 一 种 快 速 而 又 简 单 地 将 基 因 运 送 到 细 胞 内 的 技 术 。这 种 技 术 有 很 多 优 点 :可以直接输送质粒,不必像一些病毒载体系统那样构建复杂的生物载体。理论上,用基因枪技术能够将D N A 输送到任何细胞。 D N A 能穿透细胞壁、细胞膜、角质层或者其他保护性结构,而且,输送不受细胞表面受体或分子的限制。 作者:T.弗里德曼等,译者:殷
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