类器官培养与应用实验宝典

1、组织样本要求样本类型：适用于新鲜的手术或穿刺组织或积液，推荐用于培养的实体肿瘤组织质量为0.5～1g，积液体积为 500ml 以上，肿瘤组织比例含量为 50% 以上。样本保存：样本采集后在 2～8℃ 条件下保存于类器官培养专用组织保存液中，为保证初始细胞活性，建议样本离体后于 24 小时内处理。2、组织样本预处理组织清洗：将组织转移至无菌的 50ml 离心管中，加入 20～30ml 无菌 D-

1、将细胞悬液与基质胶按照一定的比例充分混匀，通常基质胶的使用浓度 ＞70%（本步骤操作应在冰上进行，避免基质胶凝固）。用预冷的枪头吸取 50 μl 含基质胶的细胞悬液，接种至 37℃ 预热的培养皿中，避免产生气泡。2、将接种完细胞的培养皿放入 CO2 培养箱内（37℃，5% 的 CO2 浓度）静置 2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固（约 10~15min）。待胶滴充分凝固后，向

类器官传代（1）轻轻吸去培养基，各孔加入500μl凝胶消化液（以24孔培养板为例）；（2）使用凝胶消化液润湿1 ml的枪头尖端，并用该枪头尖端将步骤（1）中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打，吹打时避免产生气泡，将胶滴吹散，放入冰盒上消化20 min；Tips：建议尽可能将胶滴吹散，避免影响消化效率。使用移液器吹打时，应避免移液枪头尖端接触到皿底。（3）消化好的细胞悬液收集到 15 ml 无菌

1.类器官收集（1）轻轻吸去培养基，各孔加入 500μl 凝胶消化液（以 24 孔培养板为例）；（2）使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端，并用该枪头尖端将步骤（1）中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打，吹打时避免产生气泡，将胶滴吹散，放入冰盒上消化 20 min；Tips：建议尽可能将胶滴吹散，避免影响消化效率。使用移液器吹打时，应避免移液枪头尖端接触到皿底。（3）固定：弃去上层培养基，

1、取材将小鼠断颈处死后，放在 75% 乙醇中浸泡 2 次，转移至生物安全柜；小鼠腹部向上摆放，用镊子轻轻夹起小鼠生殖口上 1cm 处皮毛，用剪刀以 V 形斜纵向剪开皮毛；更换镊子和剪刀，轻轻夹起腹膜以同样方式剪开腹膜，在小鼠左侧肝脏下找到小鼠呈荷包状的胃；取小鼠小肠，胃后连着肠，取近胃端 10～15cm 的小肠部分，置于盛有冰 D-PBS 的 100mm 培养皿中， 使用镊子去除肠道外部的膜、血

1、取材将小鼠断颈处死后，放在 75% 乙醇中浸泡 2 次， 转移至生物安全柜；小鼠腹部向上摆放，用镊子轻轻夹起小鼠生殖口上 1cm 处皮毛，用剪刀以 V 形斜纵向剪开皮毛；更换镊子和剪刀， 轻轻夹起腹膜以同样方式剪开腹膜。取近肛门端大约 10cm，去除盲肠部分，置于盛有冰 D-PBS 的 60mm 培养皿中，使用镊子去除肠道外部的膜、血管和脂肪。用注射器从结肠一端注入 D-PBS 反复冲洗，至内

1、取材将小鼠断颈处死后，放在 75% 乙醇中浸泡 2 次，转移至生物安全柜；小鼠腹部向上摆放，用镊子轻轻夹起小鼠生殖口上 1cm 处皮毛，用剪刀以 V 形斜纵向剪开皮毛；更换镊子和剪刀，轻轻夹起腹膜以同样方式剪开腹膜，在小鼠左侧肝脏下找到小鼠呈荷包状的胃，将胃取出，减去不必要的筋膜部分；用 D-PBS 将其涮洗 3 次，沿胃半径较大的弧侧用剪刀剪开，用预冷的 D-PBS 充分涮洗去除胃里面杂质后

肿瘤类器官先前已被证明可以对衍生它们的肿瘤进行表型分析，从而允许体外药物反应与原始肿瘤中存在的遗传改变相关联。

诱导拟胚体（EB）形成（1~2h）1、当人多能性干细胞 ESCs/iPSCs 在 6 孔板中长到融合度为 70%～80% 时用于诱导 EB，通常每个六孔板孔的细胞可用于诱导一整个 96 孔板。对于无饲养层培养的 ESCs/iPSCs：用 1ml 的无钙镁的 D-PBS 洗涤细胞后，向每孔中加入 600μl 的含 0.5mM 的 EDTA 的无钙镁的 D-PBS 溶液。培养箱孵育 4min；轻柔吸出