小鼠脑类器官培养实战操作步骤

75% 乙醇，D-PBS，mTeSR1 培养基， Matrige，Accutase，台盼蓝试剂，ROCK 抑制剂 Y-27632，ESCs 培养基，手术剪镊，震动反应器，37℃ 恒温培养箱

诱导拟胚体（EB）形成（1~2h）

1、当人多能性干细胞 ESCs/iPSCs 在 6 孔板中长到融合度为 70%～80% 时用于诱导 EB，通常每个六孔板孔的细胞可用于诱导一整个 96 孔板。

对于无饲养层培养的 ESCs/iPSCs：

• 用 1ml 的无钙镁的 D-PBS 洗涤细胞后，向每孔中加入 600μl 的含 0.5mM 的 EDTA 的无钙镁的 D-PBS 溶液。培养箱孵育 4min；
• 轻柔吸出 EDTA 溶液，注意不要破坏克隆，加入 1ml 的 Accutase。放回培养箱孵育 4min；
• 用 1ml 的 mTeSR1 培养基吹散克隆，使其从培养皿底部脱落。转移 2ml 至 15ml 离心管中，用 1ml 移液器将克隆吹散为浑浊的单细胞悬液；
• 270g 室温离心细胞 5min，同时用台盼蓝检测死细胞，用血细胞仪或自动细胞计数仪细胞计数；检测两次取平均值；
• 用 1ml 的含 50μM 的 ROCK 抑制剂 Y-27632 的低 bFGF 的 ESCs 培养基重悬细胞，吹打，保证细胞呈单细胞重悬的状态。然后，用含 Y-27632 的低 FGF-2 的培养基重悬细胞，使细胞浓度为每 150μl 含 9000 个活细胞；
•  每个 96 孔板孔中放入 150μl 的细胞悬液，置于培养箱继续培养；

饲养 EB，早期胚层分化（5~7 d）

2、24h 后，显微镜下观察，可见有清晰边缘的小的 EB 形成，边缘有许多死细胞围绕在 EB 周围，为正常现象，不会干扰 EB 在中间形成，继续置于 37 ℃ 的 5% CO₂ 的培养箱中培养；

3、隔天轻柔地吸去半量培养基，避免干扰到 EB 和底部的细胞，补充 150 μl 的新鲜培养基，培养基中添加 Y-27632（1：100），FGF-2 浓度为 4ng/ml，直到 EB 直径大于 350~450μm 为止，通常，仅前 4 天需要添加二者；

4、EB 直径达到 350~600μm 时，用 3 中的培养基隔天饲养 EB，培养基中不含 Y-27632 和 FGF-2；

原始神经上皮的诱导（4~5 d）

5、EB 直径达到 500~600 μm 时，边缘开始变得明亮，并且呈现光滑的边缘（通常为第 6 天），将每个 EB 用剪掉枪头的 200μl 移液器转移至含有 500 μl 的神经诱导培养基的低吸附 24 孔板中，继续培养；

6、转移至 24 孔板后，另外加入 500μl 的神经诱导培养基饲养 EB；

7、2d 后，组织培养显微镜观察 EBs，形态边缘变得更加明亮，提示神经外胚层的分化；一旦这些区域开始显示与神经上皮形成一致的假复层上皮的放射状组织，这一般发生在神经诱导培养基中的 4～5d 后，继续进行第 8 步，将神经外胚层组织转移至 Matrigel 液滴中（1~2h）；

8、4 ℃ 下冰上解冻 Matrige；

9、将 Parafilm 膜置于一个空的带有凹坑的中号枪头盒上，将手指按向 Parafilm 膜形成凹坑，每个坑的体积约为 200 μl；

10、将 Parafilm 膜用剪刀修剪为单个含 4×4（共 16 个）凹坑大小的正方形，将其放入 60mm 的组织培养皿中；

11、用 200μl 的移液器转移神经外胚层组织，每个凹坑中放置 1 个；

12、用未剪头部的 200μl 移液器小心地吸去组织边缘多余的培养基；

13、每个组织快速滴入 Matrigel，每孔约 30μl，使 Matrigel 滴入 Parafilm 凹坑中；注：快速滴入 Matrigel，避免组织干掉。尽量一次性滴入 Matrigel，一次性包埋好 16 个组织；

14、用 10μl 的移液枪头移动组织，使组织位于液滴的中央，这一步需要在滴入 Matrigel 后立即进行，因为室温下 Matrigel 非常容易固化；

15、将此 60mm 培养皿置入 37℃ 培养箱中，孵育 20~30 min 以使 Matrigel 聚合；

16、取出 60mm 培养皿，加入 5ml 不含 Vitamin A 的脑类器官分化培养基；

17、将 Parafilm 膜反过来并摇动培养皿，直至 Matrigel 液滴从凹坑中滴入培养基中；不容易脱落的液滴可以用镊子用力晃动 Parafilm 膜使其脱落，将培养皿置于培养箱中继续培养组织。

神经上皮芽的固定培养（4 d）

18、24h 后，观察包埋的组织，1~3d 内，组织会呈现包含液体空腔的进一步扩张的神经上皮样；

19、将液滴继续培养 24h，然后将培养基更换为不含 Vitamin A 的脑类器官分化培养基，继续培养 48h；

脑组织的生长（～1 年）

20、4h 的静止培养后，用开口约为 3mm 的剪去头部的 1ml 移液枪头将包埋好的类器官转移至 125ml 的震动反应器中，加入 75~100ml 的含 Vitamin A 的脑类器官分化培养液，将此生物反应器放置在培养箱中安装的磁搅拌板或轨道振动筛上用 85rpm 的速度震动。

21、振动筛上的类器官每 3~4 天全量换液，摇瓶上的类器官每周换液，注意观察形态；在合适的时间点取样本用于实验研究；