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全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验
可编程核酸酶已成为一种新的有前途的基因扰动技术,能够精确识别和切割目标 DNA,特别是来自微生物的 CRISPR (簇状规则间隔短回文重复序列)免疫系统的 RNA 引导的核酸内切酶 Cas9 已被证明对 DNA 的精确修饰具有强大的功能。与大型混合单向导 RNA(sgRNA)文库一起,Cas9 可以介导许多表型的高通量LOF和功能获得 (GOF) 研究,并阐明复杂的生物学问题。作为 CRISPR- Cas9 系统用于筛选的实用性证明,基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除 (GeCKO) 
实验概况收录 8 操作方法 · 3 相关问答 · 3 相关文章
二代测序确定 sgRNA 文库的 sgRNA 分布
插入缺失率可以用 SURVEYOR 核峻酶测定法或新一代测序技术测定,新一代测序技术更适合对大量 sgRNA 作用杷标位置进行采样。
操作方法所属实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验
免疫荧光定位法
1.  在22x22 mm 的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%~70%汇合。2.   在-20℃用100%甲醇固定细胞3分钟。3.  用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分钟。4.  在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。5.  用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分钟。6.  在湿盒里与稀释为4 ug/ml 的荧光标记二抗室温温育1小时。7.  用PBS洗四次,每次10分钟。8.  用封片剂将盖玻片封在载波片上,用干净的指甲油将盖玻片封边,防止盖玻片滑动。
操作方法所属实验:核蛋白的免疫荧光定位实验
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Methods and Software in NGS for TE Analysis

The recent development of next-generation sequencing (NGS) technologies allowed various authors to imagine, test, and validate new approaches for TE analysis, in their nature, type, activity, or quantity. In this chapter, we describe briefly

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ChIP & ChIP-Seq实验原理与成功要素及NGS测序数据分析解读

染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是用于检测细胞核天然染色质结构内的蛋白质与DNA之间相互作用的通用经典技术。近些年来NGS测序技术快速发展,基于NGS测序技术的ChIP-Seq测序分析为用户提供了蛋白质/DNA相互作用的高分辨率基因组范围视图,这是使用实时PCR分析无法实现的。ChIP-seq测序分析因此成为一种适合研究正常发育过程中或病理状态下发生的表观遗传变化的强大技术。 本次研讨会主要内容包括: 1.ChIP和ChIP seq的区别

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免疫PCR
5 min;30个周期:变性94℃5 min,退火58℃1 min,延伸72℃1 min,最后延伸72℃ 5 min,得到的PCR产物为特定的261 bp的片段。 1.  用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度; 2.  加50 μl于微孔板内,4℃过夜。同时设阴性对照(加50 μl 0.85% NaCl于另一孔内); 3.  用400 μl的0.05% 温20pBS(以下简称TPBS),洗涤五次; 4.  加入2.25%的100 μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时;⒌  用含0.15
操作方法所属实验:免疫 PCR
🔥 组织免疫荧光实验(IF)
水中放置 1 min;6、抗原修复:放置于 1 x CB 中,微波炉 80% 火力 4 min,40% 火力 8 min,冷却至室温;7、(可选步骤)0.3% Triton室温通透 15 min;8、封闭:吸干组织周围液体,滴加 10% NGS,放置于湿盒内,37 ℃ 30 min或室温 2 小时;9、一抗:按抗体说明书建议比例使用 1% NGS 稀释抗体;吸干组织周围液体,滴加稀释好的一抗,其中阴性对照组仅滴加 1% NGS,放置于湿盒内,37 ℃ 孵育 2 小时,或 4 ℃过夜;10、放置于 1 x PBS
操作方法所属实验:免疫荧光技术
实验问答143 围观
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高通量测序(NGS)的原理简介

高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS),是相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX sequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer

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Use of Next Generation Sequencing (NGS) Technologies for the Genome-Wide Detection of Transposition

, a pipeline that we have developed to detect Transposable Elements-associated structural variants (TEASVs) using Next Generation Sequencing (NGS) technologies.

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收集基因组DNA用于筛选分析
柱之间的连接并以足够的速度和时间进行离心分离,以除去所有残留的缓冲液。建议最后再进行干燥离心以去除残留的洗涤缓冲液。冻存的细胞沉淀 或分离的 gDNA 可以在 -20 ℃ 下保存几个月。B. 制备 gDNA 以进行二代测序分析。扩大反应数量,以便扩增所有从筛选中收集的 gDNA。每个 50 μL 反应最多可容纳 2.5 μg gDNA。条形码 NGS-Lib-Rev 引物可在混合测序程序中对不同筛选条件和bioreps(即实验条件 biorep 1 和对照条件 biorep 1)进行测序。C. 扩增
操作方法所属实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验
🔥 免疫组化染色实验(IHC)
性过氧化物酶阻断:滴加 3% 过氧化氢,室温于湿盒内放置 10 min 后,蒸馏水中放置 1 min;6. 抗原修复:放置于 CB 中,微波炉 80% 火力 4 min,40% 火力 8 min,冷却至室温;7.(可选步骤)0.3% Triton 室温通透 15 min;8.  封闭:吸干组织周围液体,滴加 10% NGS,放置于湿盒内,37 ℃ 30 min 或室温 2 小时;9.  一抗:按抗体说明书建议比例使用 1% NGS 稀释抗体;吸干组织周围液体,滴加稀释好的一抗,阴性对照组仅滴加
操作方法所属实验:免疫组化
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Nature子刊:著名遗传学家揭示NGS实验中错误来源以及如何减少错误方法

相关专题 著名遗传学家George Church等人综述二代测序(NGS)实验中错误的来源,以及怎样利用重复去避免或减少这些错误发生。相关文章发表于2013年12月10日的《Nature Reviews genetic s》杂志上。 尽管测序 技术在不断发展,但不论是哪种测序平台,测序过程中都不可避免地存在一些错误。 2011年7月发表在《Nature Biotechnology》上的一篇文章就曾为研究人员以及杂志审稿人敲响了警钟。文章指出

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哺乳动物细胞基因/基因组编辑

基因编辑技术的飞速发展, 特别是近年来 CRISPR 技术的广泛应用,使得人类拥有了前所未有的改变和修饰基因组的能力。CRISPR 技术来源于细菌本身对抗噬菌体的「免疫系统」,这项技术利用单链引导 RNA (sgRNA) 和 Cas9 蛋白,可以在体内和体外简单、迅速、低成本实现基因编辑。利用 CRISPR 技术不仅可以对编码基因进行有效编辑和基因组的大规模筛选,而且还可以结合 NGS 对非编码 RNA(ncRNA)进行功能研究。CRISPR 技术已经广泛应用于全球各个实验室,几乎

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验证候选基因以筛查表型
对同一时期多达 96 个不同样本进行多重W代测序。对于每一个验证的 sgRNA, 设计自定义第1轮 NGS 引物(NGS-indel-Rl),可扩增以 sgRNA 切割位点为中心的 100~300 bp区域。设计距离靶标切割位点至少 50 bp 的引物 很重要,以允许检测更长的插入/缺失。目标退火温度为 60 ℃,使用 Primer- BLAST 检查潜在的脱靶位点。如有必要,包含 1~10 bp 的交错区域以增加文库的多样性。2. 从验证细胞系中收集 gDNA。将验证细胞以 60% 的密度接种
操作方法所属实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验
重组展示病毒滴度的检测
[HyClone], In sect Xpress [Biowhittaker],或 S/-900 II SFM [Invitrogen])甲 基 纤 维 素(〇. 6 % m/V O 溶 于 昆 虫 细 胞 培 养 基高温灭菌甲基纤维素,再加人培养基,搅拌过夜。封 片 液(如 Mowiol; CalWochem)正 常 山 羊 血 清(NGS)使用前用 PBS-Tween 以 1 :30 比例稀释。PBS/Tween (PBS-T , 0. 05%Tween 20)磷酸盐缓冲液(P B S
操作方法所属实验:基于杆状病毒的展示和基因传递系统
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微量样本核酸研究背景

至单个细胞或其他类型的微量样本如何提取核酸?想要了解微量核酸是否足够用于下游的PCR或NGS实验?想要寻找微量核酸放大方案,以便用于后续的多次以及多种研究手段?在本专题中都可以找到答案。

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